Development of Glycosaminoglycans Analysis Method for Dried blood spot as a Second-tier Test in Mucopolysaccharidoses Screening

Význam tématu

Vrozené poruchy metabolismu glykosaminoglykanů (GAG) neboli mucopolysacharidózy (MPS) vedou k hromadění nestrávených GAG v organizmu, což způsobuje závažné multisystémové projevy. V novorozeneckém screeningovém programu se standardně měří aktivita lyzosomálních enzymů, avšak nízké hladiny aktivity mohou být mylně interpretovány u pseudodeficience (PD). Zavedení metody druhého stupně založené na přímé analýze GAG v sušených krevních kapkách (DBS) může výrazně zlepšit selektivitu a snížit míru falešných pozitiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit novou vysoce citlivou a reprodukovatelnou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci pěti klíčových disacharidů vzniklých enzymatickou disacharidifikací GAG extrahovaných ze suchých krevních kapek. Metoda má sloužit jako druhostupňový test v rámci screeningového procesu MPS ke zpřesnění detekce pacientů a vyloučení pseudodeficiencí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: DBS odebrané u 100 zdravých novorozenců a 3 pacientů s MPS II.
Úprava vzorku: extrakce z 2×3 mm punch DBS, přidání enzymů (chondroitináza B, heparitináza, keratanáza II), inkubace, srážení proteinů metanolovou srážkou.
Chromatografie: UHPLC Nexera X3 s HILIC aminosilná kolona, gradientní eluční režim, mobilní fáze 5 mmol/l amonného formiátu ve vodě (A) a v acetonitrilu (B), průtok 0,3 mL/min, teplota 40 °C, injekční objem 3 µL.
Spektrometrie: LCMS-8060 triple kvadrupól (Shimadzu), ESI negativní mód, MRM monitoring pěti disacharidů: Di-4S (dermatan sulfát), DiHS-0S a DiHS-NS (heparan sulfát), mono- a di-sulfátované keratan sulfáty.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární rozsah od 25 ng/mL do 500 ng/mL (pro keratan sulfáty až do 2 500 ng/mL), koeficienty korelace R > 0,994. Relativní standardní odchylky retenčních časů a plošných odpovědí nepřekročily 5 % (n = 6–10). Analýza reálných vzorků odhalila významné zvýšení HS u pacientů s MPS II (průměrné hodnoty HS u pacientů vs. kontrol 505,06 vs. 220,0 ng/mL), což umožňuje spolehlivou diferenciaci od zdravých jedinců. Testování PD vzorků nebylo dosaženo z důvodu omezeného počtu dostupných vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Využití DBS minimalizuje objem krevního vzorku a usnadňuje logistiku novorozeneckého screeningu.
• Druhostupňové stanovení GAG snižuje počet falešně pozitivních výsledků spojených s pseudodeficiencí enzymu.
• Metoda nabízí vysokou citlivost, reprodukovatelnost a krátký čas analýzy vhodný pro rutinní laboratorní provoz.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o další typy MPS a další GAG jako chondroitin sulfáty, optimalizovat pro plně automatizované přístrojové linky a zvýšit throughput. V budoucnu je reálné nasazení multiplexních metod kombinujících enzymové testy a GAG analýzu v jednom workflow. Dále je možné integrovat bioinformatiku pro prediktivní hodnocení rizika MPS a PD.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda založená na enzymatické disacharidifikaci DBS umožňuje citlivou a specifickou kvantifikaci pěti disacharidů GAG. Validace prokázala vynikající přesnost, linearitu i opakovatelnost. Aplikace na reálné vzorky potvrdila schopnost spolehlivě rozlišit zdravé novorozence od pacientů s MPS II. Metoda je vhodná jako druhostupňový screeningový test a přispěje ke zvýšení přesnosti novorozeneckého screeningu MPS.

Reference

Z textu nebyla k dispozici samostatná bibliografická sekce.