A rapid LC-MS/MS method to measure simultaneously IDUA, IDS, NAGLU, GALNS and ASRB enzymes activities in dried blood spots

Význam tématu

Včasné odhalení mucopolysacharidóz (MPS) u novorozenců je klíčové pro zahájení léčby a prevenci trvalých orgánových poškození. Validní multiplexní analýza aktivity lyzosomálních enzymů v suchých krevních skvrnách (DBS) umožňuje efektivní screening několika substrátových defektů současně a zvyšuje průchodnost laboratorních vyšetření.

Cíle a přehled studie

Studie představuje novou, rychlou LC-MS/MS metodu k simultánnímu stanovení aktivit pěti lyzosomálních enzymů: IDUA (MPS I), IDS (MPS II), NAGLU (MPS IIIB), GALNS (MPS IVA) a ARSB (MPS VI) v DBS pro screening novorozenců. Cílem bylo dosáhnout krátkého analytického cyklu s vysokou spolehlivostí a dostatečnou selektivitou produktů enzymatické reakce.

Použitá metodika a instrumentace

Proces zahrnoval:

• Punch disku 3 mm z DBS a vložení do 96-well desky
• Přidání koktejlu se substráty a deuterovanými interními standardy
• Inkubaci při 37 °C, 400 rpm po dobu 16 h
• Quench reakcí a následnou extrakci kapalina-kapalina
• On-column LC-MS/MS analýzu v MRM módu

Hlavní přístroje a podmínky:

• UHPLC Nexera MP se sloupcem Phenomenex Kinetex XB-C18 (150 × 2,1 mm, 1,7 µm; nebo 30 × 2,1 mm pro zkrácenou metodu)
• Triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr LCMS-8050
• Mobilní fáze A: voda + 0,1 % kyseliny mravenčí, B: acetonitril + 0,1 % kyseliny mravenčí
• Analytické cykly 6 min a optimalizovaná verze 2,5 min

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda byla validována na 312 normálních novorozeneckých vzorcích a QC materiálech. Selectivní chromatografické rozlišení produktů od substrátů eliminovalo rušivé signály z in-source dekompozice. Měření vykázalo konzistentní aktivity pro každou z pěti enzymů, s možností spolehlivě odlišit normální a patologické hodnoty.

Přínosy a praktické využití metody

Výhodou nové metody je:

• Multiplexní detekce pěti lyzosomálních enzymů v jednom běhu
• Vysoký zdroj dat s malým objemem vzorku (3 mm DBS)
• Možnost zavedení do rutinního screeningu novorozenců
• Potenciál pro další zkrácení analýzy na 2,5 min

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k automatizaci přípravy vzorků, rozšíření panelu enzymů a integraci s datovými platformami pro rychlou interpretaci výsledků. Technologický vývoj hmotnostních spektrometrů a vysokopropustných LC systémů umožní další zkrácení času a zlepšení citlivosti.

Závěr

Představená LC-MS/MS metoda nabízí rychlý, spolehlivý a multiplexní přístup ke screeningovému stanovení pěti lyzosomálních enzymů v DBS. Díky optimalizované chromatografii a detekčním podmínkám lze rutinně měřit aktivity s vysokou selektivitou v analytickém cyklu do 6 min, s perspektivou zkrácení na 2,5 min pro masové newborn screening programy.

Reference

1. Liu Y et al. Clin Chem. 2017, 63(6):1118-1126