Measurement of Enzymatic Activities in Dried Blood Spots with On-Line Solid Phase Extraction-LC/MS/MS System

Význam tématu

Metoda stanovení enzymatické aktivity lysozomálních hydroláz v sušených kapkách krve (DBS) umožňuje citlivé a multiplexní vyšetření poruch metabolismu sloučenin akumulovaných v lysozomech. Díky minimalizaci předúpravy vzorku a automatizovanému online SPE-LC/MS/MS lze dosáhnout vyššího průtoku a reprodukovatelnosti, což je klíčové pro screening novorozenců i klinickou biochemii.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo validovat online systém pevné fáze-extrakce (SPE) spojené s kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS) pro simultánní měření aktivity tří lysozomálních enzymů: alpha-iduronidázy (IDUA), acid alpha-glukosidázy (GAA) a alpha-galaktosidázy A (GLA) ze suchých kapek krve. Studie vychází z protokolu Meyerské dětské nemocnice ve Florencii.

Použitá metodika a příprava vzorků

• Vzorky: Disky o průměru 3,2 mm vysekány z DBS a umístěny do 96-jamkové destičky.
• Enzymatická reakce: Přidání substrátů pro IDUA, GAA, GLA a deuterovaných interních standardů; inkubace 22 h při 37 ˚C v humidním prostředí.
• Online SPE: Zachycení produktů reakce na sloupci POROS R1 pomocí vodné fáze (0,05 % HCOOH, 5 mM HCOONH4) při průtoku 1,2 mL/min, následné přepnutí ventilu k eluci analyzátů směsí methanolu s 0,1 % kyseliny mravenčí.
• Chromatografická separace: Shim-pack XR-ODS (75×2,0 mm, 2,2 µm), gradient 50 % B, průtok 0,6 mL/min, teplota kolony 30 °C, injekce 2 µL, doba analýzy 5,5 min.

Použitá instrumentace

• LCMS-8050 (Shimadzu) s ESI+ ionizací.
• SPE kolona: POROS R1 (30×2,1 mm, 20 µm).
• Analytická kolona: Shim-pack XR-ODS (75×2,0 mm, 2,2 µm).
• Podmínky MS: Interface 100 °C, DL 100 °C, Heat Block 100 °C, plyny: nebulizace 3 L/min, sušení 15 L/min, nosný 5 L/min.
• MRM přechody pro produkty a interní standardy (IDUA, GAA, GLA).

Hlavní výsledky a diskuse

Systém umožnil přímou injekci vzorků po enzymatické reakci bez dodatečných čistících kroků. Vzorky kontrolní populační skupiny vykázaly výrazné metabolity. V discorinovaných vzorcích chybějících specifických enzymů (vzorky B, C, D) došlo k potlačení signálu odpovídajících produktů, což potvrzuje selektivitu a citlivost metody. Výpočet aktivity vycházel z poměru plocha produktu/IS, objemu přidaného roztoku a doby inkubace.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost a automatizace díky online SPE eliminuje časově náročné kroky manuální purifikace.
• Multiplexní stanovení tří lysozomálních enzymů v jedné analýze šetří čas i vzorek.
• Vhodné pro screening novorozenců a podpůrné klinické testování metabolických poruch.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření panelu analyzovaných enzymů, integrace do rutinačního screeningového workflow a využití pokročilých datových analýz pro kvantitativní interpretaci výsledků. Další vývoj může zahrnovat miniaturizaci a přenosné platformy pro rychlé testování v terénu.

Závěr

Online SPE-LC/MS/MS systém představuje efektivní, citlivou a vysoce selektivní metodu pro měření lysozomálních enzymatických aktivit v DBS. Díky minimalizaci předúprav a zkrácení doby analýzy má potenciál zefektivnit screening a diagnostiku metabolických onemocnění.

Reference

• la Marca G et al., Anal. Chem. 81 (2009) 6113-6121
• Ombrone D et al., Eur. J. Mass Spectrom. 19 (2013) 497-503