Data-independent Acquisition (DIA) Approach on Q-TOF Mass Spectrometry for In-depth Peptide Mapping of Monoclonal Antibodies

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je zásadní pro ověření jejich primární struktury a kvality. Tradiční approach porovnává vzorek s referenčním produktem, což je časově náročné a vyžaduje vysokou reprodukovatelnost přípravy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem tohoto příspěvku je představit datově nezávislou akvizici (DIA) na Q-TOF hmotnostním spektrometru LCMS-9030 pro hluboké de novo sekvenování trypticky štěpených peptidů bevacizumab biosimiláru. Studie demonstruje kompletní pokrytí sekvence obou řetězců mAb bez potřeby paralelního standardu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek bevacizumabu (1 mg/mL) byl redukován, alkylován a digesován trypsinem. Peptidy byly analyzovány na LCMS-9030 Q-TOF se Shim-pack GISS-HP kolonkou (150×3,0 mm, 3 µm). Mobilní fáze obsahovala 0,1% FA a 0,01% TFA ve vodě a acetonitrilu s gradientem 0–75% B během 40 min. DIA akvizice probíhala s pevnými okny 40 Da v rozsahu 210–1690 m/z. Výstupní data (.mzML) z LabSolutions byla zpracována v MS-DIAL (minimální výška signálu 1500) a přenosy fragmentů byly predikovány v Skyline.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila identifikovat a de novo sekvenovat 61 peptidů světelného řetězce a 42 peptidů těžkého řetězce, pokrývajících 100% aminokyselinové sekvence bevacizumabu. Extrahovaná MS/MS spektra odpovídala teoretickým přenosům b a y iontů, což potvrdilo správnost sekvenčních odhadů. DIA režim zajišťuje komplexní a nepředsudkovou fragmentaci, vhodnou i pro nízkoabundatní peptidy.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní de novo pokrytí primární struktury mAb bez referenčního standardu
• Zkrácení času analýzy a snížení závislosti na reprodukovatelnosti přípravy
• Vysoká citlivost pro identifikaci i středně a nízkomolekulárních peptidů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace workflow pro rutinní QA/QC laboratoře
• Rozšíření DIA metody na další terapeutické proteiny a komplexní proteomické studie
• Vývoj pokročilých bioinformatických nástrojů pro přesnější deconvoluci smíšených spekter

Závěr

Popsaná DIA strategie na LCMS-9030 Q-TOF umožňuje rychlé, spolehlivé a úplné de novo sekvenování mAb peptidů. Metoda zjednodušuje peptidovou analýzu, eliminuje potřebu srovnávacího standardu a otevírá cestu k robustnímu monitoringu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Searle BC, Pino LK, Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry, Nat Commun 9 (2018): 5128.
2. MS-DIAL: http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/index.html.
3. Skyline software: https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=default.
4. Shimadzu (Asia Pacific), Peptide Mapping of Monoclonal Antibody (mAb) Using LCMS-9030 (Q-TOF) Mass Spectrometer with a Shim-pack GISS-HP Column, Application News AD-0212B (2019).