Disulfide Bond Characterization of Monoclonal Antibody (mAb) Using Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou nejrychleji rostoucí skupinou bioterapeutik s významným vlivem na diagnostiku i léčbu. Struktura disulfidových vazeb určuje prostorové složení protilátek a tím jejich biologickou aktivitu, stabilitu a imunogenní vlastnosti. Přesná charakterizace disulfidových vazeb je proto klíčová pro stanovení kritických kvalitativních atributů (CQA) výrobků založených na mAb.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní LC-MS metodu pro detailní mapování disulfidových vazeb v biosimiláru bevacizumabu. Studie porovnává analýzu za neredukovaných podmínek, kde vazby zůstávají intaktní, a za redukovaných podmínek s použitím DTT a následnou alkylací IAM.

Použitá metodika a instrumentace

Denaturace probíhala za použití surfaktantu ProteaseMAX a následného trávení trypsinem. Redukce a alkylace byly provedeny DTT a iodoacetamidem. Analýza byla realizována na LCMS-9030 (Q-TOF) od Shimadzu s klíčovými parametry:

• Kolona Shim-pack GISS-HP (3 µm, 150×3,0 mm)
• Mobilní fáze A: 0,1 % FA + 0,01 % TFA ve vodě, B: 0,1 % FA + 0,01 % TFA v acetonitrilu
• Gradient od 0 do 75 % fáze B během 35 min
• Heated ESI v pozitivním módu, TOF rozsah 100–2000 m/z
• Interface 300 °C, DL 250 °C, heat block 400 °C
• Nebulizační plyn N2 3 L/min, sušící plyn N2 10 L/min

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila detekci 8 intaktních disulfidových peptidů v neredukovaném vzorku a 15 Cys-obsahujících peptidů v redukovaném vzorku s hmotnostní přesností lepší než 3 ppm. Porovnání chromatogramů ukázalo výrazné rozdíly v profilech peptidů. De novo sekvenování reprezentativních peptidů S-S-2 (neredukovaný) a S3 (redukovaný) potvrdilo správné přiřazení vazeb a sekvencí na základě MS/MS fragmentace.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda poskytuje rychlé a spolehlivé mapování disulfidových vazeb v biosimilárech mAb. Díky vysoké hmotnostní přesnosti a detailní MS/MS analýze lze ověřit integritu vazeb, zkrátit časy analýzy a tím zefektivnit vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření může zahrnovat automatizaci vyhodnocení dat, využití technik top-down nebo native MS, integraci fragmentačních metod ETD/ECD pro komplexnější charakterizaci a aplikaci na studium dalších posttranslačních modifikací.

Závěr

Popsaná LC-MS metoda na přístroji LCMS-9030 (Q-TOF) umožňuje detailní a přesnou charakterizaci disulfidových vazeb v monoklonálních protilátkách. Prokázaná robustnost a spolehlivost ji činí vhodnou pro aplikace ve vývoji a kontrole kvality mAb biosimilárů.

Reference

• Žádné explicitně uvedené literární zdroje