Structure Characterization and Differentiation of Biosimilar and Reference Products Using Unique Combination of Complementary Fragmentation Mechanisms

Význam tématu

Charakterizace strukturálních rozdílů mezi biosimilárními a referenčními proteinovými produkty je nezbytná pro prokázání kvality, bezpečnosti a účinnosti. Kombinace vysokého rozlišení hmotnostní spektrometrie a komplementárních fragmentačních technik umožňuje detailní mapování sekvence, post-translačních modifikací i glykoformací na úrovni jednotlivých aminokyselin.

Cíle a přehled studie

Cílem je vytvoření robustního LC-MS/MS workflow pro rozlišení jemných strukturálních rozdílů mezi originálním tkáňovým aktivátorem plazminogenu (TPA), jeho rekombinantní variantou I-TNK a biosimilarem G-TNK. Metoda využívá dvoustupňovou fragmentaci HCDpdETD a nové softwarové nástroje k identifikaci, lokalizaci a kvantifikaci modifikací.

Použitá metodika

Vzorky byly redukovány, alkylovány a štěpeny trypsinem. Peptidy se oddělovaly na 50 cm C18 kolonce v režimu nanoUHPLC s gradientem metanol-acetonitril / vodného roztoku kyseliny mravenčí. Hmotnostní spektrometrie probíhala na Orbitrap Fusion Tribrid v režimu datově závislého sběru: nejprve HCD pro obecnou MS/MS analýzu, při detekci oxoniových iontů glykanů se na tutéž prekurzorovou částici spouštělo ETD pro přesné určení vazebné osnovy a místa glykozylace. Kvantifikace peptidů a peptidových modifikací byla provedena ve softwaru PepFinder 1.0 s tolerancí 5 ppm.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Orbitrap Fusion Tribrid
• Thermo Scientific EASY-ETD ion source
• Thermo Scientific EasySpray zdroj a nanoUHPLC
• C18 kolona 50 cm, 2 μm částice
• Thermo Scientific PepFinder 1.0 pro analýzu LC-MS/MS dat

Hlavní výsledky

• 100 % pokrytí aminokyselinové sekvence u všech tří vzorků.
• Identifikace čtyř glykozylačních míst: N103 (G-TNK a I-TNK), N117 (TPA), N184 (pouze I-TNK, 19 % obsazenost) a N448 (všechny varianty, >99 % obsazenost).
• Komparativní analýza glykoformací na N448 odhalila konzistentní složení s převahou sialylovaných forem; na N103 a N117 se profil glykoform lišil mezi variantami.
• Detekce dalších PTM: cysteinová alkylace, deamidace na 12 asparaginech (např. N140, N142 s rozdílnou obsazeností), dvojná oxidace zbytku W406, formylace a glykace.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost i pro nízkou abundanci PTM a glykoform.
• Site-specific identifikace glykozylace i dalších modifikací.
• Komplexní porovnání biosimilární a referenční šarže v režimu lot-to-lot a studii srovnatelnosti.
• Škálovatelný přístup pro rutinní QA/QC v biotechnologickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj zahrnuje integraci s metodami datově nezávislé akvizice (DIA), pokročilou umělou inteligencí podporovanou analýzu dat a rozšíření do řízení kvality glykoformací a jiných variant na úrovni bioprocesu. Automatizace workflow a využití strojového učení pro predikci a rozpoznání vzorů PTM zvýší efektivitu a reprodukovatelnost v biopharma vývoji.

Závěr

Vyvinuté LC-MS/MS workflow s HCDpdETD na Orbitrap Fusion a softwarovou analýzou PepFinder 1.0 poskytuje úplné sekvenční pokrytí, přesnou lokalizaci glykozylace i dalších PTM a kvantitativní porovnání biosimilárního a referenčního produktu. Metoda odhalila zásadní rozdíly v glykoformách a deamidacích, čímž podporuje vývoj, validaci a kontrolu kvality proteinových léčiv.