In-depth Peptide Mapping of Monoclonal Antibody (mAb) by A de novo Peptide Sequencing Method on Q-TOF Mass Spectrometer with Data-independent Acquisition

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčové pro potvrzení primární struktury, detekci bodových mutací a sledování posttranslačních modifikací. Tradiční přístupy vyžadují porovnání se referenčním vzorkem a jsou časově i materiálově náročné. Data independent acquisition (DIA) na Q-TOF spektrometrech nabízí genetický, nebiased přístup pro systematické záznamy fragmentačních dat a umožňuje de novo určování pořadí aminokyselin bez nutnosti předchozí knihovny peptidů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat workflow pro hloubkovou charakterizaci struktury mAb (bevaci­zumab) pomocí de novo peptidového sekvenování v režimu DIA na spektrometru Shimadzu LCMS-9030 (Q-TOF). Autoři stanovili plné pokrytí aminokyselinových sekvencí lehkého a těžkého řetězce peptidů (celkem 61 tryptických fragmentů), ověřili jejich sekvence a ilustrovali proces na vybraném peptidu ALPAPIEK.

Použitá instrumentace

• UHPLC Shimadzu Nexera X2
• Kolona Shim-pack GISS-HP, 3 µm, 150 × 3,0 mm, 40 °C
• Spektrometr Shimadzu LCMS-9030 (Q-TOF) s heated ESI zdrojem
• Software LabSolutions pro export, MS-DIAL pro extrakci dat, Skyline pro predikci a kontrolu fragmentů

Použitá metodika

Vzorek bevacizumabu byl denaturován, redukován (DTT) a alkylován (iodoacetamidem), poté diges­tován trypsinem přes noc. K injekci do LCMS-9030 byla připravena koncentrace 5 mg/mL ve vhodném pufru. Chromatografický gradient (0–75 % organiky během 35 min) doplněný full-scan MS (100–2000 m/z) a 40 m/z DIA segmenty v rozsahu 210–1690 m/z poskytl data pro MS a MS/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí MS-DIAL bylo extrahováno 11 852 hmotnostních signálů s odpovídajícími fragmenty. Výsledky pro 42 peptidů z těžkého řetězce a 19 z lehkého řetězce vykázaly 100 % zastoupení primární struktury mAb. De novo sekvenování peptidu ALPAPIEK demonstrovalo shodu extrahovaných hmotnostních fragmentů (y- a b-iontů) s predikcí ze Skyline. Umožnilo to potvrzení pořadí aminokyselin a identifikaci drobných modifikací, např. glykozylace G0F na HC20 a odštěpení C-terminální lysinu na HC37.

Přínosy a praktické využití metody

• Autonomní identifikace peptidů bez nutnosti referenční databáze
• Vyšší reprodukovatelnost oproti komparativnímu přístupu
• Schopnost detekce PTM a bodových mutací v jediném experimentu
• Zrychlení analýzy a snížení závislosti na manuálním zpracování

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace strojového učení pro automatickou interpretaci DIA dat
• Rozšíření workflow na analýzu glykoproteinů a komplexních PTM profilů
• Využití hybridních Q-TOF/Orbitrap systémů pro vyšší rozlišení
• Standardizace metody pro rutinní kontrolu kvality v biotechnologickém průmyslu

Závěr

Studie prokázala, že MS/MS DIA režim na LCMS-9030 (Q-TOF) poskytuje robustní, nepředsudečný a plně de novo workflow pro detailní peptidové mapování mAb. Komplexní extrakce dat a ověření pomocí predikovaných fragmentací umožňuje vysokou jistotu sekvenování a detekci modifikací.

Reference

1. Searle BC, Pino LK. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (2018): 5128.
2. MS-DIAL: http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/index.html
3. Skyline: https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=default
4. Shimadzu (Asia Pacific). Peptide Mapping of Monoclonal Antibody (mAb) Using LCMS-9030 (Q-TOF). Application News, No. AD-0212B, 2019.