Anion-Exchange Chromatography for Determining Empty and Full Capsid Contents in Adeno-Associated Virus

Význam tématu

Adeno-asociovaný virus (AAV) je klíčovým nástrojem v genové terapii pro doručování terapeutických genů. Během výrobního procesu však vzniká značné množství prázdných kapsid (bez genomu), které ovlivňují účinnost, mohou vyvolat nežádoucí imunitní odpověď či naopak v některých případech zlepšit přenos genů. Proto je přesné určení poměru prázdných a naplněných kapsid esenciální pro zajištění konzistentní kvality léčivého přípravku a správné dávkování.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout a optimalizovat metodu aniontové výměnné chromatografie (AEX) na separaci a kvantifikaci prázdných a naplněných kapsid AAV8 s využitím kolony Protein-Pak Hi Res Q a UPLC systému. Studie dále zkoumala vliv pH, typu soli, pufru a přítomnosti Mg2+ na rozlišení kapsid a ověřila použitelnost metody i pro další AAV serotypy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System vybaven kolonkou Protein-Pak Hi Res Q (4,6 × 100 mm, 5 μm) při teplotě 30 °C. Mobilní fáze obsahovaly pufry (Tris-HCl, Bis-tris propane) upravené na pH 9–10 a různé typy solí (NaCl, KCl, NH4Ac, tetramethylammonium chloride). Auto•Blend Plus nebo kvaternární čerpadlo generovalo gradient. Detekce probíhala UV spektrofotometrií při 260 a 280 nm a fluorescenčně (ex 280 nm, em 350 nm). Analytická data byly zpracovány v softwaru Empower 3.

Hlavní výsledky a diskuse

• Full kapsidy se elutují později než empty, což odpovídá vyššímu aniontovému náboji díky obsažené DNA.
• Optimalizace pH ukázala lepší rozlišení na pH 9 ve srovnání s pH 10.
• Tetramethylammonium chloride poskytl nejlepší rozlišení mezi prázdnými a naplněnými kapsidami oproti jiným solím.
• Přidání 2 mM Mg2+ nemělo výrazný vliv na kvalitu separace AAV8, ale může být užitečné pro jiné serotypy.
• Fluorescenční detekce prokázala výrazně vyšší citlivost než UV, umožňující detekci nízkých množství kapsid.
• Vícekrokové směšování prázdného a plného standardu potvrdilo lineární odezvu a umožnilo stanovit relativní fluorescenční korekční faktor pro kvantifikaci.
• Test na AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8 a AAV9 ukázal rozdílné retenční časy, což naznačuje potřebu drobné úpravy metody pro různé serotypy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda AEX na kolonce Protein-Pak Hi Res Q umožňuje rychlou (desítky minut) a reprodukovatelnou separaci malého objemu cenného materiálu (μL) s vysokou citlivostí fluorescenční detekce. Celkové stanovení poměru empty/full kapsid je snáze validovatelné než u AUC a méně náročné na množství vzorku než při UV spektroskopii či TEM.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace pro různé AAV serotypy a jejich kombinace.
• Integrace AEX s hmotnostní spektrometrií pro detailní analýzu částečně naplněných kapsid.
• Využití alternativních pufrů a solí pro zlepšení rozlišení méně běžných serotypů.
• Automatizace kvantifikace pomocí pokročilých softwarových nástrojů a AI.

Závěr

Aniontová výměnná chromatografie na kolonce Protein-Pak Hi Res Q ve spojení s citlivou fluorescenční detekcí představuje robustní a citlivou metodu pro rychlé rozlišení a kvantifikaci prázdných a naplněných AAV kapsid. Správná optimalizace pH, typu soli a dalších parametrů je klíčová pro zajištění přesnosti a opakovatelnosti výsledků.

Reference

1. Li C., Samulski R. J., Nature Reviews Genetics, 2020.
2. Gao K. et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 2014, 1(9): 20139.
3. Flotte T. R., Hum. Gene Ther., 2017, 28(2): 147–159.
4. Burnham B. et al., Hum. Gene Ther. Methods, 2015, 26(6): 228–237.
5. Sommer J. M., Mol. Ther., 2003, 7(1): 122–128.
6. Horowitz E. D. et al., J. Virol., 2013, 87(6): 2994–3002.
7. Subramanian S. et al., Hum. Gene Ther., 2019, 30(12): 1449–1458.
8. Pierson E. E. et al., Anal. Chem., 2016, 88: 6718–6725.
9. Fu X. et al., Hum. Gene Ther. Methods, 2019, 30(4): 144–153.
10. Wang C. et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 2019, 15: 257–263.
11. Nass S. A. et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 2017, 9: 33–46.