Determination of Full, Partial and Empty Capsid Ratios for Adeno-Associated Virus (AAV) Analysis

Význam tématu

Analýza poměru plných, částečných a prázdných kapsid adeno-asociovaného viru (AAV) je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti genové terapie. Nedostatečně naplněné kapsidy mohou snižovat účinnost terapie, zvyšovat immunogenicitu a komplikovat cílení na buňky. Rychlé a spolehlivé stanovení těchto poměrů je proto nezbytné pro vývoj, výrobu a kontrolu AAV vektorů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo představit robustní metodu založenou na kapilární izoelektrickém zaměřování (cIEF) pro analýzu poměrů plných, částečných a prázdných kapsid AAV. Studie ukazuje schopnost této techniky rozlišit různé druhy kapsid s vysokým rozlišením a porovnat ji s ortogonálními přístupy, jako je aniontová výměnná chromatografie (AEX-HPLC).

Použitá metodika a instrumentace

• Platforma: PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System (SCIEX) s UV detektorem při 280 nm.
• Metoda: capillary isoelectric focusing (cIEF) s širokými i úzkými pH ampholyty pro optimalizaci rozlišení.
• Vzorky: AAV serotypy 5, 8 a 9 a proprietární varianty s obohacenými plnými nebo prázdnými kapsidami.
• Referenční metody: AEX-HPLC na sloupci CIMac SO3-0.1 a porovnání s AUC, TEM a spektrofotometrií.

Hlavní výsledky a diskuse

• cIEF umožnila separaci prázdných, částečných a plných kapsid s rozdíly pI až 0,1 jednotky.
• Využití směsi širokého (pH 3–10) a úzkého (pH 6–8) rozsahu ampholytů výrazně zlepšilo rozlišení u serotypů s malými pI rozdíly.
• Opakovatelnost metody byla vysoká (%RSD <5 % pro plochu a <2 % pro pI), což potvrzuje reprodukovatelnost výsledků.
• cIEF výsledky korelovaly s AEX-HPLC (% odchylka <3 %), přičemž cIEF dále rozeznala částečné kapsidy, které AEX-HPLC nerozlišila.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý analytický čas <1 hodiny na vzorek šetří personální i finanční prostředky.
• Vysoká citlivost a rozlišovací schopnost podporuje QC uvolňování terapeutických vektorů.
• Vyhovuje různým serotypům AAV bez nutnosti zásadních úprav metody.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace cIEF s hmotnostní spektrometrií (CDMS) pro detailní charakterizaci heterogenity kapsid.
• Automatizace a miniaturizace pracovního toku pro vysokoprodukční screening.
• Rozšíření metodiky na další viry a nanovektory v genové terapii.

Závěr

cIEF představuje robustní, rychlou a vysoce rozlišovací metodu pro kvantifikaci plných, částečných a prázdných kapsid AAV. Díky vysoké reprodukovatelnosti, možnosti analýzy různých serotypů a kompatibilitě s ortogonálními technikami je ideální volbou pro QC a vývoj genových vektorů.

Reference

• 1. Wright J. Product-Related Impurities in Clinical-Grade Recombinant AAV Vectors. Biomedicines 2014;2:80–97.
• 2. Burnham B. et al. Analytical ultracentrifugation for rAAV. Hum Gene Ther Methods 2015;26(6):228–242.
• 3. Chen H. Comparative TEM and AFM of rAAV2. Microscopy and Microanalysis 2007;13(5):384–389.
• 4. Zhou ZH. CryoEM in gene delivery vehicle imaging. Structure 2012;20(8):1286–1288.
• 5. Sommer JM et al. Quantification of AAV particles by optical density. Mol Ther 2003;7(1):122–128.
• 6. Goricar B. et al. Multi-angle light scattering for AAV10. Poster 2019.
• 7. Lock M. et al. Ion-exchange chromatography for rAAV8. Hum Gene Ther Methods 2012;23:56–64.
• 8. Pierson EE et al. Charge detection MS for AAV heterogeneity. Anal Chem 2016;88(13):6718–6725.