Developing the analytics and analytical workflows supporting the analysis of the next generation of biotherapeutic and gene therapies

Význam tématu

Adeno‐associated virus (AAV) je klíčový vektor pro genovou terapii. S narůstajícími nároky na kvalitu a bezpečnost bioterapeutik je nutné vyvinout robustní, citlivé a vysoce reprodukovatelné analytické workflow. Optimalizace metod pro stanovení velikostních distribucí, poměru prázdných a plných kapsid, čistoty a modifikací proteinů přispívá ke zkrácení vývojových cyklů a zajištění stability a účinnosti finálních produktů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem je představení integrovaných metod chromatografie a hmotnostní spektrometrie pro charakterizaci AAV kapsid. Seminář popisuje:

• Rozdělení a agregace částic pomocí SEC–MALS.
• Stanovení prázdných/plných kapsid metodou aniontové výměnné chromatografie (AEX).
• Analýzu a kvantifikaci kapsidových proteinů (VP1, VP2, VP3) pomocí RP‐LC/MS a fluorescence.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzy byly využity platformy Waters:

• ACQUITY UPLC H-Class Plus Bio s kolumnami BEH450 SEC (450 Å), BEH C4/C8/C18 pro SEC a RP separace.
• Detektory FLR (exc. 280 nm, em. 350 nm), UV/PDA a hmotnostní detektor RDa (BioAccord).
• Multi‐angle light scattering (μDAWN MALS) pro přesná měření mol. hmotností.
• IonHance CX‐MS pufry pro stabilní a reprodukovatelné LC‐MS rozhraní.
• Cyclic IMS a vysokorozlišovací TOF analyzátory pro detailní charakterizace.

Hlavní výsledky a diskuse

SEC na BEH450 dovolilo rozlišit přirozené agregáty AAV a monomery u všech testovaných sérotypů (1,2,5,6,8,9). AEX s ProteinPak Hi Res Q obdobně rozlišilo prázdné a plné kapsidy s lineární závislostí 0–100 % prázdných částic. Optimální podmínky: 20 mM Bis‐Tris pufr pH 9, gradient 100–300 mM tetraalkylamoniových solí, detekce FLR. RP‐LC/MS s modifikátorem DFA poskytlo vysoce rozlišené chromatogramy a umožnilo měřit vztah VP1:VP2:VP3, identifikovat clipped formy a fosforylace. Fluorescenční detekce zvýšila citlivost až 20× oproti UV. Peptidová mapování odhalila PTM, nicméně nízké koncentrace proteinů a překrývající se sekvence vyžadují optimalizaci protocolů.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow poskytuje:

• Rychlé a kvantitativní stanovení agregace a integrity kapsid.
• Přesné měření poměru prázdné/plné frakce s minimálním vzorkem.
• Detailní charakterizaci VP proteinů a modifikací metodami LC‐MS.
• Možnost přenosu metod mezi různými sérotypy s nenáročnou úpravou podmínek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se vývoj SEC materiálů s většími póry pro lentiviry a jiné vektory (>100 nm). Integrace CDMS přinese jednočásticové měření poměru prázdných/plných částic. Rozšíření iontové mobility (cyclic IMS) umožní hloubkovou separaci izobarických forem a komplexních PTM. Automatizace přípravy vzorků pomocí robotických platforem (Andrew Alliance) zefektivní throughput a sníží variability.

Závěr

Prezentované chromatograficko‐hmotnostní workflow kombinuje optimalizované SEC, AEX a RP‐LC/MS metody pro komplexní analýzu AAV vektorů. Díky využití specializované instrumentace a pufrů lze dosáhnout vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a flexibility nezbytné pro vývoj a kontrolu kvality genových terapií.

Reference

• Fu X. et al. “Charge variant analysis of AAV capsids”, Human Gene Therapy, 2019, 30(4).
• Ujma J. et al. “High‐resolution cyclic IMS for biomolecular separations”, Analytical Chemistry, 2019.
• Waters Corporation Methods Resource, www.methods.waters.com.