Salt gradient separation and analysis of adeno-associated virus samples using a 3 μm monodisperse strong anion exchange chromatography column

Význam tématu

V současné genové terapii hrají virusové vektory jako adeno-asociované viry zásadní roli díky své nízké imunogenicitě a bezpečnosti. Kvalita terapeutického AAV závisí na poměru prázdných a plných kapsid, který ovlivňuje účinnost přenosu genetického materiálu. Tradiční metody, jako analytická ultracentrifugace, jsou časově náročné a laborativní. Silově výměnná chromatografie (SAX) nabízí rychlou a robustní alternativu pro separaci, kvantifikaci a charakterizaci AAV částic a zároveň umožňuje kontrolu přítomných nečistot.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované aplikace bylo demonstrovat vývoj a optimalizaci metod založených na solném gradientu pro separaci prázdných a plných AAV kapsid. Studie využívá monodisperzní 3 µm silově výměnnou kolonu ProPac 3R SAX v kompaktním formátu 2 × 50 mm. Metoda je navržena tak, aby byla snadno rozvíjitelná a reprodukovatelná napříč různými šaržemi kolon.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy byly provedeny na UHPLC systému s kvaternárním čerpadlem a fluorescenční detekcí. Klíčové komponenty:

• Kolona ProPac 3R SAX 3 µm, 2 × 50 mm
• Vanquish Flex Quaternary UHPLC systém s PEEK hardwarem
• Fluorescenční detektor Ex 280 nm Em 330 nm
• Mobilní fáze obsahuje tetramethylamoniový chlorid a BIS TRIS propane pH 9

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární solný gradient umožnil oddělení prázdných a plných kapsid u sérií AAV1, AAV6 a AAV8 s hodnotami rozlišení nad 1,3. Reprodukovatelnost mezi třemi šaržemi kolon ProPac 3R SAX byla vysoká s minimálními odchylkami ve retenčních časech a ploše píku. Při optimalizaci pro AAV6 byla zavedena izokratická fáze v jediném stupni solného gradientu. Úprava koncentrace mobilní fáze B na 17 % a izokratické doby na čtyři minuty vedla k výraznému zvýšení rozlišení do hodnoty nad 4 při zachování symetrického tvaru píků.

Přínosy a praktické využití metody

Nově vyvinutá metoda nabízí:

• Rychlé a vysoce rozlišující stanovení poměru prázdných a plných kapsid
• Vysokou citlivost díky fluorescenční detekci při nízkých objemech vzorku
• Reprodukovatelnost mezi šaržemi chromatografické kolony
• Možnost přímé integrace v GMP prostředí pro kontrolu kvality výrobních šarží

Budoucí trendy a možnosti využití

V budoucnu lze očekávat kombinaci SAX metod s dalšími orthogonálními technikami jako cryo EM nebo AUC pro validaci kvantitativních výsledků. Dalším směrem je rozšíření analýzy na další serotypy a konstrukty AAV, stejně jako automatizace metod pro vysokoprocesní screening v bioprodukci. Využití pokročilých datových analýz a strojového učení může přispět k lepší interpretaci komplexních chromatografických profilů.

Závěr

ProPac 3R SAX kolona s monodisperzním 3 µm sorbentem umožnila efektivní a reprodukovatelnou separaci prázdných a plných AAV kapsid. Implementace lineárního solného gradientu s izokratickou fází přinesla výrazné zlepšení rozlišení a citlivosti. Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality genových terapeutik a lze ji snadno adaptovat na různé AAV vzorky.

Reference

1. Rittié L Athanasopoulos T Calero-Garcia M Davies ML Dow DJ Howe SJ Morrison A Ricciardelli I Saudemont A Jespers L Clay TM Molecular Therapy 2019 27 1706–1717
2. Wagner C Innthaler B Lemmerer M Pletzenauer R Birner-Gruenberger R International Journal of Molecular Sciences 2022 23 12715
3. Aebischer MK Gizardin-Fredon H Lardeux H Kochardt D Elger C Haindl M Ruppert R Guillarme D D’Atri V International Journal of Molecular Sciences 2022 23 12332
4. Khatwani S Pavlova A Pirot Zhu Molecular Therapy Methods Clinical Development 2021 21 548–558
5. Rivera B Anspach JA Rao S LCGC Supplements 2018 36 24–29
6. Wang C Mulagapati SHS Chen Z Du J Zhao X Xi G Chen L Linke T Gao C Schmelzer AE Liu D Molecular Therapy Methods Clinical Development 2019 15 257–263