Separation and analysis of adeno-associated virus vectors using a 3 μm monodisperse strong anion exchange chromatography column

Význam tématu

Analýza a kvantifikace prázdných a plných kapsid adeno-asociovaných virů (AAV) je zásadní pro hodnocení kvality vektorů genové terapie. Správné stanovení poměru plných/prázdných částic ovlivňuje biologickou účinnost i bezpečnost léčebných přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat metodu silně aniontové výměnné chromatografie (SAX) pro oddělení a charakterizaci prázdných a plných AAV kapsid pomocí 3 µm monodisperzního ProPac™ 3R SAX sloupce. Metoda byla testována na sérotypech AAV1, AAV6 a AAV8, včetně hodnocení lineárního gradientu i přidání izokratické fáze.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Flex
• Fluorescenční detektor (Ex: 280 nm, Em: 330 nm)
• Software Chromeleon 7.2.10 CDS pro akvizici a analýzu dat

Metodika:

• Kolona: ProPac™ 3R SAX, 3 µm, 2 × 50 mm
• Mobilní fáze A – voda; B – 1 M tetrametylamoniumchlorid; C – 200 mM Bis‐Tris propan, pH 9,0
• Teplota: 20 °C; Průtok: 0,2 mL/min; Objem injekce: 0,2 µL
• Lineární soli gradient a izokratická fáze optimalizované pro maximální rozlišení

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární gradient zajistil baseline separaci prázdných a plných kapsid pro AAV1, AAV6 a AAV8 s přítomností vedlejších impurit u některých sérotypů. Relativní plocha signálů odpovídala očekávanému poměru 1:10, přičemž fluorescenční citlivost se lišila pro prázdné a plné kapsidy.
Přidání izokratické fáze při 17 % mobilní fáze B zlepšilo tvar píku plné kapsidy (Asy≈1) a zvětšilo rozlišení od píku prázdných částic. Delší doba izokratického zadržení však vedla k rozšíření píku a snížení intenzity signálu plné kapsidy.
Mezi šaržemi sloupce ProPac 3R SAX byla potvrzena vysoká reprodukovatelnost retencí a rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení prázdných a plných kapsid i při nízkých injektovaných objemech
• Robustní a reprodukovatelné výsledky vhodné pro QA/QC laboratoře
• Flexibilní přizpůsobení gradientních i izokratických podmínek dle typu vzorku

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o vysokoprůtokové a mikročipové platformy, automatizované screenování podmínek a integraci s ortogonálními technikami (AUC, cryo-EM) pro přesnější kvantifikaci. Další směr spočívá v aplikaci strojového učení pro návrh optimálních chromatografických protokolů.

Závěr

ProPac 3R SAX 3 µm sloupec nabízí efektivní, vysoce reprodukovatelnou separaci prázdných a plných AAV kapsid pomocí lineárního gradientu i izokratické fáze, což usnadňuje implementaci v rutiních analýzách genové terapie.

Reference

1. Wang C.; Mulagapati S. H. S.; Chen Z. et al. Developing an Anion Exchange Chromatography Assay for Determining Empty and Full Capsid Contents in AAV6. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019;15:257–263.
2. Aebischer M. K.; Gizardin‐Fredon H.; Lardeux H. et al. Anion‐Exchange Chromatography at the Service of Gene Therapy: Baseline Separation of Full/Empty Adeno‐Associated Virus Capsid. Int J Mol Sci. 2022;23(20):12332.
3. Khatwani S. L.; Pavlova A.; Pirot Z. et al. Anion‐exchange HPLC assay for separation and quantification of empty and full capsid in multiple adeno‐associated virus serotypes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021;21:548–558.
4. Ma K.; Bechler S. Salt gradient separation and analysis of adeno‐associated virus samples using a 3 µm monodisperse strong anion exchange chromatography column. Thermo Fisher Scientific AN001816‐EN 0223S.
5. Mietzsch M.; Liu W.; Ma K. et al. Production and Characterization of an AAV1‐VP3 Only Capsid: An Analytical Benchmark Standard. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023.