Characterization of Monoclonal Antibody Biosimilar through C-terminal and Disulfide Bond Peptides Sequencing Analysis on Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Peptidové mapování C-koncových a disulfidových peptidů je nezbytné pro kontrolu kvality biosimilárních monoklonálních protilátek jako je bevacizumab. Tyto analýzy odhalují varianty střihu C-konce (např. ztráta lysinu) a postradukační modifikace disulfidových vazeb, které ovlivňují účinnost a bezpečnost terapeutických proteinů.

Cíle a přehled studie

Tento výzkum se zaměřil na identifikaci a kvantifikaci:

• tří C-koncových peptidů tvořených variantami s a bez ztráty C-terminálního lysinu
• patnácti cystein-vazebných peptidů u bevacizumabu biosimiláru

Aplikace metody LC-QToF-MS umožnila simultánní detekci a potvrzení přesných monoisotopových hmotností s chybovostí pod 2 ppm.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek bevacizumabu byl redukován DTT, alkylován IAM a štěpen trypsinem. Peptidový směs byla analyzována na LCMS-9030 (Shimadzu) s následujícími podmínkami:

• kolonka Shim-pack GISS C18, 5 μm, 250×4,6 mm
• gradientní eluční režim 0–50 % acetonitrilu/85 min
• ESI-QToF v režimu MS a MS/MS, hmotnostní rozsahy 50–1900 m/z
• extrakce iontových chromatogramů (EIC) s přesností <2 ppm

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala:

• detekci tří C-koncových peptidů: hlavní forma se ztrátou lysinu dominovala (>99 % relat. abund.), varianta s lysinem přítomna v menším podílu
• identifikaci patnácti disulfidově vázaných peptidů pokrývajících intra- a inter-řetězcové cysteiny
• de novo sekvenování potvrzené MS/MS fragmentací (y-ionty a b-ionty anotovány u vybraných peptidů)
• důkaz karbamidomethylové modifikace u vybraných cysteinů a její vliv na retenční časy

Diskuse podtrhuje spolehlivost EIC-based přístupu pro rychlou identifikaci peptidů a potvrzení strukturní integrity výrobku.

Přínosy a praktické využití metody

Tato strategie nabízí:

• rychlou a citlivou kontrolu C-terminálních variací, které mohou ovlivnit farmakokinetiku
• komplexní profil disulfidových vazeb pro potvrzení správné prostorové konformace
• možnost aplikace v rutině QC laboratoří pro ověřování biosimilárních výrobků

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný vývoj zahrnuje:

• automatizaci datové analýzy a AI-podporované de novo sekvenování
• rozšíření na další posttranslační modifikace (glykozylace, oxidace apod.)
• implementaci vysoce propustných metod pro masivní screening biosimilárních šarží

Závěr

Provedená LC-MS/MS analýza na Q-ToF systemu prokázala spolehlivou detekci a sekvenování C-koncových i disulfidově vázaných peptidů bevacizumabu biosimiláru. Metoda je vhodná pro rutinní QC charakterizaci biosimilárních monoklonálních protilátek.

Reference

(1) Dick LW Jr., Qiu D., Mahon D., Adamo M., Cheng K. C-terminal lysine variants in fully human monoclonal antibodies: Investigation of test methods and possible causes. Biotech Bioeng. 100, 1132-1143 (2008).