Characterization of C-terminal and Disulfide Bond Peptides of Monoclonal Antibody (mAb) on Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza monoklonálních protilátek je klíčovou součástí kontroly kvality biotechnologických léčiv. Identifikace a sekvenace C-terminálních a disulfidových peptidů zajišťuje, že struktura biosimiláru odpovídá originálnímu produktu. Tento přístup je nezbytný pro ověření konzistence výrobních procesů a pro potvrzení terapeutických vlastností látky.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo provést peptide mapping a MS/MS sekvenaci C-terminálních peptidů a peptidů vázaných disulfidovými můstky u bevacizumab biosimiláru. Analýza byla realizována na systému LCMS-9030 (Q-TOF) a zahrnovala potvrzení přítomnosti a modifikací klíčových peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Biosimilární vzorek bevacizumabu byl redukován DTT, alkylován iodoacetamidem a digesován trypsinem při 37 °C. Peptidové směsi byly analyzovány chromatograficky na koloně Shim-pack GISS C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) s gradientem formiové kyseliny v acetonitrilu. Přístrojové parametry LCMS-9030 zahrnovaly:

• Režim ESI positive
• Rozsah m/z 250–2500
• Teploty zdroje: interface 300 °C, dl 250 °C, block 400 °C
• Plyny: dusík (nebulizační 3 L/min, sušící 10 L/min), topný vzduch 10 L/min

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekováno bylo 15 cystein-obsahujících peptidů a 3 C-terminální peptidy.
• Metoda EIC (< 2 ppm) umožnila rychlou identifikaci peptidů a jejich modifikací (karbamidomethylace).
• U C-terminálního peptidu HC byla potvrzena varianta s odštěpenou lyzinovou zbytkou (clipping), přičemž odštěpená forma dominovala.
• MS/MS de novo sekvenování pokrylo všechny klíčové y-fragmenty, což potvrdilo sekvence peptidů C-terminálních a disulfidových vazeb.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda poskytuje spolehlivý nástroj pro kontrolu kritických kvalitativních atributů (CQA) biosimilárních protilátek.
• Rychlá a citlivá detekce modifikací zefektivňuje validaci výrobního procesu.
• De novo sekvenování zabezpečuje potvrzení neznámých sekvencí bez potřeby referenčních knihoven.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pokročilých softwarových řešení pro automatizaci analýzy peptide mappingu.
• Rozšíření metody na další monoklonální protilátky a komplexní biologika.
• Využití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie v kombinaci s bioinformatikou pro detailní profilaci modifikací.

Závěr

Studie prokázala, že LCMS-9030 Q-TOF spolu s metodou EIC poskytuje robustní platformu pro charakterizaci C-terminálních a disulfidových peptidů u biosimilárních protilátek. Přístup je vhodný pro rutinní kontrolu kvality a potvrzení shody s originálním léčivem.

Reference

1. Dick LW Jr, Qiu D, Mahon D, Adamo M, Cheng K. C-terminal lysine variants in fully human monoclonal antibodies: Investigation of test methods and possible causes. Biotechnology and Bioengineering. 2008;100(6):1132–1143.
2. Protein Metrics. Byos software, produktová dokumentace.
3. MacCoss Lab. Skyline: Documentation and tutorials.
4. Shimadzu Asia Pacific. Peptide Mapping of Monoclonal Antibody (mAb) Using Nexera Bio with Q-TOF Mass Spectrometer for Full Sequence Confirmation. Application News No. AD-0176; 2019.