IMSC: Full Characterization of Heterogeneous Antibody Samples Under Denaturing and Native Conditions on a Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Analytická charakterizace monoklonálních protilátek na úrovni intact proteinu, podjednotek i peptidů je klíčová pro vývoj a výrobu biofarmaceutik. Heterogenita terapeutických proteinů vyplývá z glykosylace, chemických modifikací a dalších variací, které ovlivňují jejich účinnost a bezpečnost. Analýza v nativních podmínkách s minimem organického rozpouštědla a neutrálním pH snižuje nabité stavy a umožňuje detekci intact molekul ve vyšších m/z pásmech s lepším prostorovým rozlišením.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo provést komplexní charakterizaci tří komerčně dostupných monoklonálních protilátek (Trastuzumab, Infliximab, Bevacizumab) pomocí tří hlavních pracovních postupů:

• Intact analýza ve srovnání nativních a denaturačních podmínek.
• Analýza podjednotek po enzymatickém štěpení (IdeS/FabRICATOR®) a redukci.
• Peptidové mapování po proteolytické digestu pomocí SMART Digest™ kitu, včetně disulfidového mapování.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly zpracovány dvěma způsoby desaltingu: offline pomocí Bio-Rad P6 kolonek a online pomocí MAbPAC SEC a RP kolonek na Vanquish UHPLC. Pro subunit analýzu byl použit enzym FabRICATOR® (IdeS) a standardní redukce TCEP nebo DTT. Peptidy vzniklé SMART Digest™ digescí byly analyzovány reverzní fází. Hlavním detekčním zařízením byl modifikovaný hybridní kvadrupól-Orbitrapový hmotnostní spektrometr (Q Exactive™ Biopharma) v režimech Protein Mode, Enhanced Resolution Mode a novém High Mass Range Mode (rozsah až m/z 8000). Data se vyhodnocovala softwarem Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ a ProSight Lite.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intact analýza: V nativních podmínkách dochází ke snížení nabitých stavů a detekci intact molekul ve vyšších m/z s vyšším rozlišením. Drug-to-antibody poměr a glykana profily ADC vzorků byly spolehlivě kvantifikovány.
• Subunit analýza: IdeS digest a redukce poskytly dobře oddělené výtěžky lehkého (LC), těžkého (HC) a Fc fragmentu. Top-down analýza subjednotek umožnila potvrdit sekundární modifikace a sekvenční potvrdění.
• Peptidové mapování: 100% sekvenční pokrytí pro všechny protilátky, kvalitní identifikace glykosylovaných forem a disulfidových můstků. Byly odhaleny očekávané i neočekávané (scrambled) disulfidové vazby a nízký stupeň C-terminální Lys-trunkce u Infliximabu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení analytických workflow kombinací offline/online desaltingu a rychlou přímou infuzí.
• Možnost podrobné charakterizace intact protilátek a ADC v jedné instrumentální platformě.
• Spolehlivé potvrzení sekvence, glykosylačních vzorů a disulfidových vazeb pro QA/QC procesy ve farmaceutickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření nativní MS do analýzy komplexních proteinových komplexů a konjugátů s rozsahem m/z nad 8000.
• Automatizované multi-atributové monitorování (MAM) pro kontinuální kontrolu kvality bioterapeutik.
• Pokročilé top-down a middle-down strategie pro přímé mapování modifikací a variant na intact úrovni.

Závěr

Provedená studie demonstruje robustní přístup ke komplexní charakterizaci monoklonálních protilátek napříč intact, subunit a peptidovou úrovní na jediné HPLC-MS platformě. Nový High Mass Range Mode výrazně rozšiřuje možnosti analýzy nativních protilátek a podporuje detailní zjištění modifikací, glykosylačních forem a disulfidových vazeb s vysokou přesností a rozlišením.