Multiple ion chromatogram (MIC) for direct quantification of intact proteins using Q-TOF mass spectrometry

Význam tématu

Přímá kvantifikace intaktních proteinů hraje klíčovou roli při výrobě, charakterizaci a klinickém výzkumu proteinových produktů. Tradiční metody založené na enzymatickém štěpení jsou časově náročné a mohou vést ke ztrátě informací o kompletní struktuře proteinu. Metoda multiple ion chromatogram (MIC) využívající Q-TOF MS nabízí rychlý, citlivý a přímý přístup k měření intactních proteinů bez nutnosti předchozího trávení.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout, optimalizovat a ověřit MIC na systému Shimadzu LCMS-9030 Q-TOF pro přímou kvantifikaci vybraných intactních proteinů. Studie se zaměřila na:

• výběr standardních proteinů (ribonukleáza B s pěti glykoformami, lysozym, β-laktoglobulin A, inzulín),
• optimalizaci chromatografických a spektrometrických podmínek,
• stanovení liniarity, citlivosti, přesnosti, precizity a matrických efektů v séru a moči.

Použitá metodika a instrumentace

Separace proběhla na koloně ProteCol-G C8 (100 × 2,1 mm, 3 µm) s gradientem 20–80 % acetonitrilu v 0,1 % TFA. Analýza byla provedena na LCMS-9030 Q-TOF s horkou ESI ionizací (300 °C, interface 4 kV) a detekcí v m/z 1000–3500 v režimu pozitivních iontů.

• Průtok: 0,3 mL/min, vstřik: 5 µL,
• plyny: N₂ pro nebulizaci (3 L/min) a sušení (15 L/min),
• teploty: interface 300 °C, heat block 400 °C, DL 250 °C,
• výběr iontů: tři nejintenzivnější středy nabití (+6, +7, +8) s tolerancí 5 ppm pro MIC.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla vysoké liniarity (R² > 0,997) v rozsahu 5–200 µg/mL pro většinu proteinů (20–200 µg/mL pro některé glykoformy, 2–50 µg/mL pro inzulín). LOD se pohybovaly mezi 0,32–5,40 µg/mL a LOQ mezi 1,13–17,99 µg/mL. Přesnost (RSD < 15 %) a věrnost (chyba < 20 %) byly v rámci akceptovatelných mezí. V séru a moči byl zaznamenán signifikantní iontový enhancement, což vyžaduje průběžné monitorování matrických efektů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá přímá analýza intactních proteinů bez potřeby štěpení,
• vysoká citlivost a selektivita díky kombinaci více nabitých forem,
• aplikace v QA/QC biotechnologických procesů i klinickém výzkumu,
• možnost sledování dynamiky proteinů v reálných matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na multiplexní kvantifikaci více proteinů v komplexních matricích, implementace automatizace přípravy vzorků a vývoj pokročilých softwarových nástrojů pro zpracování dat. Další perspektivou je kombinace MIC s doplňkovými detekčními technikami (UV, fluorescence) a rozšíření na analýzu posttranslačních modifikací.

Závěr

Metoda MIC na LCMS-9030 Q-TOF představuje efektivní, citlivý a přímý přístup ke kvantifikaci intactních proteinů. Splňuje požadavky na linearitu, citlivost, přesnost a precizitu a je vhodná pro rutinní implementaci v bioprocesní kontrole kvality a klinickém výzkumu.

Reference

1. Mao Y, Moore RJ, Wagnon KB, Pierce JT, Debban KH, Smith CS, Dill JA, Fuciarelli AF, Analysis of α2u-globulin in rat urine and kidneys by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry, Chem. Res. Toxicol. 11 (1998): 953-961.
2. Wang EH, Combe PC, Schug KA, Multiple Reaction Monitoring for Direct Quantitation of Intact Proteins Using a Triple Quadrupole Mass Spectrometer, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (2016): 886-896.