Developing High Resolution HILIC Separations of Intact Glycosylated Proteins Using a Wide-Pore Amide-Bonded Stationary Phase

Význam tématu

Vývoj vysoce selektivních HILIC separací pro intaktní glykosylované proteiny představuje klíčovou metodiku v analýze biopolymerů. Umožňuje detailní charakterizaci glykoproteinových vzorků, včetně glykochemických modifikací zásadních pro funkci terapeutických protilátek. Díky orthogonální selektivitě vůči reverzní fázi doplňuje existující chromatografické přístupy u QA/QC a výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo navrhnout optimalizovanou HILIC metodu založenou na širokoporézní amido-vázané stacionární fázi BEH Amide 300Å (1,7 µm) pro separaci intaktních a digesovaných glykoproteinů o hmotnosti 10–150 kDa. Studie zahrnuje vývoj podmínek iontového párování, podmínění kolony, injekčního postupu a porovnání s konvenční RP-LC, včetně kompatibility s ESI-MS.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém: ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• Stacionární fáze: ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide 300Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm (také 2,1×100 mm)
• Mass spektrometr: Xevo G2 QTof s ESI v režimu pozitivních iontů
• Vzorky: RNase A/B, trastuzumab, Intact mAb Mass Check Standard deglykované PNGase F
• Mobilní fáze: voda a ACN modifikované 0,1 % TFA (optimalizováno), alternativně 50 mM močovina formiátu pH 4,4 či 0,5 % kyselina mravenčí
• Podmínky: teplota kolony 30–80 °C, průtok 0,2 mL/min, objem injekce ≤1 µL pro 2,1 mm ID kolony

Hlavní výsledky a diskuse

• Progresivní zlepšování separace RNase B od 130Å unbonded až k 300Å amido-BEH 1,7 µm vyústilo v nejvyšší rozlišení glykoform Man5–Man9 a aglikoform RNase A.
• Mobilní fáze s 0,1 % TFA snížila retenci a optimalizovala rozlišení iontovým párováním na aminokyselé zbytky.
• HILIC podmínky s TFA byly plně kompatibilní s ESI-MS, umožňující přímou identifikaci a dekonvoluci hmotností glykoform.
• Zobrazena komplementární selektivita vůči RP-LC (BEH C4 300Å) pro RNase B, kde RP neodděluje jednotlivé mannosylované izoformy.
• Intaktní trastuzumab se podařilo separovat na oddělené glykoformy (G0F/G0F až G2F/G2F) při zvýšeném tlaku (7 000–7 500 psi) snížením agregace.
• Duální kolona (2×150 mm) přinesla vyšší počet teoretických destiček a zdokonalila rozlišení isoform trastuzumabu.
• Vyvinut byl HILIC-FLR-MS assay pro stanovení glykanové obsazenosti intact mAb, rozlišující -2, -1 a plně glykované formy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysoké rozlišení a reprodukovatelnost separace glykoform intaktních proteinů, přímou kompatibilitu s MS a orthogonální profil k RP. Umožňuje rychlé hodnocení glykosylace terapeutických protilátek, QC analýzy a studium míst modifikace bez nutnosti časově náročných derivačních postupů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na jiné třídy glykoproteinů a větší biomolekulární komplexy.
• Optimalizace ultravysoce tlakových UPLC systémů pro snížení artefaktů agregace.
• Integrace se sofistikovanými MS metodami (ETD, CID) pro detailní mapování postranslačních modifikací.
• Vývoj automatizovaných protokolů pro rutinní QC a rozšíření do průmyslových GMP procesů.

Závěr

Širokoporézní amido-BEH 300Å 1,7 µm stacionární fáze s 0,1 % TFA mobilní fází poskytuje dosud nevídané rozlišení intaktních glykoproteinů. Vyšetření vlivu tlaku a ortogonální selektivity rozšiřuje možnosti chromatografické charakterizace glykoform i stanovení glykanové obsazenosti intact mAb v jednom rychlém a MS-kompatibilním experimentu.

Reference

1. Ahn J., Yu Y.Q., Gilar M.: UPLC-FLR Method Development of 2-AB Labeled Glycan Separation in Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC). Waters App. Note (2010).
2. Ahn J. et al.: Separation of 2-aminobenzamide labeled glycans using HILIC columns with 1.7 µm sorbent. J Chromatogr B 878(2010)403–408.
3. Lauber M.A. et al.: Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent. Waters Application Note (2015).
4. Wang B. et al.: Reliable Determination of Site-Specific In Vivo Protein N-Glycosylation Based on Collision-Induced MS/MS and Chromatographic Retention Time. J Am Soc Mass Spec 25(2014)729–741.
5. Shah B. et al.: LC-MS/MS peptide mapping with automated data processing for profiling N-glycans in immunoglobulins. J Am Soc Mass Spec 25(2014)999–1011.
6. Houel S. et al.: N- and O-glycosylation analysis of etanercept using LC-QTof MS with ETD. Anal Chem 86(2014)576–584.
7. Gilar M. et al.: Characterization of glycoprotein digests with HILIC and MS. Anal Biochem 417(2011)80–88.
8. O’Gara J.E., Wyndham K.D.: Porous Hybrid Organic-Inorganic Particles in Reversed-Phase Liquid Chromatography. J Liq Chrom Rel Technol 29(2006)1025–1045.
9. Alpert A.J.: Hydrophilic-interaction chromatography for polar molecules. J Chromatogr 499(1990)177–196.
10. Xie H. et al.: Rapid comparison of a candidate biosimilar to innovator mAb with advanced LC-MS. mAbs 2(2010).
11. Eschelbach J.W., Jorgenson J.W.: Improved protein recovery in RP-LC by the use of ultrahigh pressures. Anal Chem 78(2006)1697–1706.
12. Neue U.D. et al.: Influence of pressure on retention of sugars in HILIC. J Sep Sci 33(2010)838–840.