Characterization of the Interactions Between High Mannose Glycans and a Novel Prokaryotic Lectin Using Mass Spectrometry-Based Approaches

Význam tématu

Glykan-lectinové interakce jsou klíčové pro přesné analýzy glykoproteinů v biomedicínských a farmaceutických aplikacích. Vysoce mannosové glykany ovlivňují imunitní odezvu a životnost terapeutických protilátek. Detailní charakterizace vazby mezi glykany a lectiny přispívá k optimalizaci metod pro kvantifikaci glykosylace a k vývoji nových ligandů pro analytické a diagnostické účely.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na systémové určení specifity, afinity a kinetiky vazby mezi vysokomannosovými N-vázanými glykany (Man5–Man11) a novým rekombinantním prokaryotickým lectinem RPL-Man2. Pro srovnání byly provedeny experimenty v roztoku pomocí Catch-and-release (CaR) MS a kinetické analýzy s His-tag imobilizovaným lectinem.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Catch-and-release native MS pro stanovení disociačních křivek a výpočet Kd v roztoku.
• Affinity pull-down kinetika s tris-NTA/polymerními částicemi a kompetitivním elučním činidlem pro určení kon a koff.

Instrumentace:

• SYNTAPT XS Mass Spectrometer se zdrojem pro Native Spray Ionization.
• Xevo G2-XS Mass Spectrometer spojený s ACQUITY I-Class UPLC.

Hlavní výsledky a diskuse

• V roztoku (CaR-MS) se disociační konstanty Kd pohybovaly od ~5 µM (Man5) až po ~0,08 µM (Man11), přičemž vyšší počet mannóz vedl k vyšší afinitě.

• Kinetická analýza imobilizovaného RPL-Man2 prokázala relativně konzistentní Kd (0,8–4 µM) napříč glycoformami, což naznačuje vliv orientace na povrchu.

• Chromatografické oddělení izomerů Man7 a Man8 odhalilo strukturovou rozmanitost, přičemž jeden izomer Man7 vykazoval nižší afinitu.

• Rozdíly mezi oběma metodami mohou vyplývat z odlišných fyzikálních podmínek (roztok vs. povrch) a metodologie měření.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje detailní mapování interakcí glykan–lectin na úrovni jednotlivých glycoform.
• Podporuje vývoj selektivních ligandů pro obohacovací analýzy a glyko-profilování.
• Aplikovatelné v QA/QC pro kontrolu glykosylace bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vyšší komplexita imobilizačních technik (nespecifické kotvení) a zkoumání jejich vlivu na kinetiku.
• Rozšíření na další typy lectinů a komplexnější glykánové knihovny.
• Integrace s hyphenovanými LC-MS přístupy pro vysokopropustné glykoanalýzy.

Závěr

Studie ukázala, že kombinace CaR-MS a kinetické pull-down analýzy poskytuje komplementární pohled na afinitu a kinetiku vazeb mezi vysokomannosovými glykany a prokaryotickým lectinem RPL-Man2. Výsledky podpořily hlubší pochopení role glykoform v selektivitě a síle interakcí, což je nezbytné pro vývoj pokročilých analytických nástrojů.

Reference

1. S. Fernandez-Poza, A. Padros, R. Thompson, L. Butler, M. Islam, J.A. Mosely, J.H. Scrivens, M.F. Rehman, M.S. Akram: Tailor-made recombinant prokaryotic lectins for characterisation of glycoproteins. Analytica Chimica Acta, 1155 (2021) 338–352.