N-Linked Glycans Analysis of Monoclonal Antibodies, Biosimilars, and Glycoproteins with High Resolution Mass Spectrometry and Fluorescence Detection using Restek’s Raptor Polar X Column and Protein Metrics’ Software Suite

Význam tématu

Analýza N-vázaných glykosidických přívěsků u monoklonálních protilátek a biosimilars je klíčová pro zajištění jejich stability, rozpustnosti a správné biologické aktivity. Různá glykosylace může ovlivnit farmakokinetiku, imunogenitu a efektivitu terapeutických proteinů, což z ní činí jednu z hlavních kritických kvalitativních atribut (CQA) v procesu vývoje a výroby bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na:

• Vyvinutí robustní metody oddělení a identifikace N-vázaných glykánů u modelových proteinů (RNase B), referenčního monoklonálního protilátkového standardu NIST mAb a biosimilárního léku Avastin.
• Optimalizaci chromatografie použitím Restek Raptor Polar X kolony kombinující iontovou výměnu se HILIC retencí.
• Posouzení hmotnostní přesnosti Q-ToF spektrometru Shimadzu LCMS-9030 a využití softwarového workflow od Protein Metrics pro automatizovanou analýzu glykánů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnovala:

1. Deglykosylaci proteinů pomocí enzymu PNGase F v pufru ammonium hydrogenuhličitanu.
2. Odstranění uvolněných glykánů extrakcí na C4 ZipTip pipetových hrotech a vysušení.
3. Fluorescenční značení procainamidem a čistění na SPE sacharidových cartrech.
4. Chromatografii na Raptor Polar X kolóně se zásadní hybnou fází: mobilní fáze A (0,5 % kyselina mravenčí ve vodě), B (90:10 acetonitril:voda s 20 mM amonnou formiátovou pufrovací solí, pH 3), gradient 88→10 % B při 0,4 mL/min, 40 °C.
5. Detekci fluorescencí (Ex 310 nm, Em 370 nm) a vysokorozlišovací Q-ToF MS v módu DDA (m/z 500–2200).

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy modelového RNase B prokázaly vynikající baseline separaci vysokomanózových glykánů Man5–Man9. U monoklonálního standardu NIST mAb a Avastinu biosimiláru byly rozlišeny a identifikovány komplexní a hybridní glykány včetně fukozylovaných a galaktosylovaných forem. Všechny analyzované glykány vykázaly hmotnostní odchylku menší než 5 ppm (u NIST mAb max. 6 ppm). Normalizované plochy chromatogramů byly znázorněny jako koláčové diagramy pro srovnání relativní distribuce glykánových forem mezi vzorky. MS/MS fragmentační spektra klíčových glykánů potvrdila charakteristické fragmenty tetrapentasacharidového jádra.

Přínosy a praktické využití metody

Tato analytická workflow umožňuje:

• Rychlé a citlivé profilování glykánových forem u terapeutických protilátek a biosimilars.
• Splnění požadavků kvalitativních atribut pro procesní validaci (QbD).
• Automatizovanou analýzu a reporting díky softwaru Protein Metrics Detached Glycan, integrující výsledky chromatografie a MS.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Rozšíření na komplexní glykoproteomiku s integrovaným online odběrem vzorku a digesčními moduly.
• Využití umělé inteligence pro predikci a kvantifikaci neznámých glykánových forem.
• Implementaci nativní MS pro analýzu intaktních protilátek a jejich glykovariant.
• Standardizaci metodiky pro regulované prostředí QA/QC.

Závěr

Kombinace Raptor Polar X kolony a vysokorozlišovacího Q-ToF MS poskytuje robustní platformu pro detailní charakterizaci N-vázaných glykosidů na monoklonálních protilátkách a biosimilars. Výsledky potvrzují vysokou hmotnostní přesnost, citlivost a reprodukovatelnost metody, což přispívá k efektivnímu monitorování CQA v biotechnologické výrobě.

Reference

1. Shen, H. et al. Development and validation of therapeutic antibodies. Journal of Biomedical Science. 2019;26:92.
2. Smith, J. Defining critical quality attributes in the pharmaceutical manufacturing process. GxP-cc News. 2014.
3. Shimadzu Application Note LCMS-103: NIST mAb Workflow QToF.
4. Ludger Procainamide Glycan Labeling Kit User Guide. Ludger Ltd. 2020.
5. Supelco Discovery Glycan SPE Tubes Technical Bulletin. Sigma-Aldrich. 2019.