Direct Quantitation of Intact Proteins By Multiple Ion Chromatogram Method on Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

V oblasti bioléčiv a proteomických aplikací je klíčové rychle a přesně stanovit hladiny intactních proteinů během výroby, charakterizace i klinického použití. Hmotnostní spektrometrie Q-TOF nabízí vysoké rozlišení a citlivost, avšak pro kvantitativní analýzu intactních proteinů dosud chyběla vhodná metodika s dostatečným dynamickým rozsahem. Zavedení multiple ion chromatogram (MIC) metody umožňuje přímou kvantifikaci bez enzymatické digesce či komplikovaného čištění, což zkracuje dobu analýzy a zvyšuje operativní efektivitu v QA/QC a výzkumných laboratořích.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce bylo navrhnout, optimalizovat a ověřit výkonnost MIC metody pro kvantitativní analýzu intactních proteinů v rozsahu přibližně 5–18 kDa na přístroji Shimadzu LCMS-9030 (Q-TOF). Jako modelové proteiny byly zvoleny ribonukleasa B (s pěti glykoformami man5–man9), insulin, lysozym a β-laktoglobulin A. Studie hodnotila linearitu, rozsahy kvantifikace, limity detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ), přesnost, reprodukovatelnost a vliv biologické matrice (sérum a moč).

Použitá metodika a instrumentace

Analytické podmínky:

• Kolona: ProteCol-G C8 (100 mm × 2,1 mm, 3 μm); teplota 50 °C
• Mobile phase A: 0,1 % TFA ve vodě; B: 0,1 % TFA v acetonitrilu
• Gradient: 20 % B (0 min) → 60 % B (20 min) → 80 % B (20,5–23,5 min) → 20 % B (24 min); průtok 0,3 mL/min; injekce 5 μL
• MS: Heated ESI pozitivní mód, interface 4 kV, DL 250 °C, nebulizace N2 3 L/min, heating gas Zero Air 10 L/min, drying gas N2 15 L/min; rozsah m/z 1000–3500

MIC vývoj:

• Výběr tří nejintenzivnějších vícenábojových iontů pro každý protein
• Určení monoisotopické hmotnosti s tolerancí 5 ppm
• Superpozice signálů vybraných iontů pro vytvoření MIC kanálu

Použitá instrumentace:

• Shimadzu LCMS-9030 Q-TOF
• ProteCol-G C8 kolona
• Standardní plyny: dusík a Zero Air

Hlavní výsledky a diskuse

Pro všechny proteiny byly získány kalibrační křivky s koeficienty lineárnosti R2 > 0,997. LOD se pohybovaly mezi 0,32 a 5,40 μg/mL, LOQ mezi 1,13 a 17,99 μg/mL. Přesnost měření (accuracy) se pohybovala v rozmezí 81–119 %, reprodukovatelnost (RSD) byla menší než 15 %. Vliv matrice (sérum, moč) způsobil zvýšení signálu v rozmezí 123–182 %, což je u ESI očekávané. Metoda prokázala spolehlivost, dostatečnou citlivost i v biologických vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda MIC na Q-TOF umožňuje:

• Přímou kvantifikaci intactních proteinů bez nutnosti enzymatické digesce
• Rychlou analýzu s minimální přípravou vzorku
• Vysokou citlivost vhodnou pro kontrolu bioléčiv a výzkum posttranslačních modifikací
• Jednoduchou adaptaci na různé proteiny a glykoformy

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciál rozšíření metody MIC zahrnuje:

• Analýzu větších proteinů a proteinových komplexů
• Integraci s mikrofluidickými systémy pro vysokopropustné screeny
• Automatizaci a nasazení v GMP prostředí
• Kombinaci s experimenty hloubkové analýzy PTM a proteomiky

Závěr

Metoda multiple ion chromatogram na Q-TOF hmotnostním spektrometru poskytuje robustní, citlivý a přesný přístup pro přímou kvantifikaci intactních proteinů v rozsahu několika až desítek kDa. Nabízí efektivní alternativu k tradičním MRM metodám s dopadem na biopharmaceutickou kontrolu kvality a klinický výzkum.

Reference

1. Mao Y, Moore RJ, Wagnon KB, Pierce JT, Debban KH, Smith CS, Dill JA, Fuciarelli AF “Analysis of α2u-globulin in rat urine and kidneys by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry”, Chem. Res. Toxicol. 11 (1998): 953–961.
2. Wang EH, Combe PC, Schug KA “Multiple Reaction Monitoring for Direct Quantitation of Intact Proteins Using a Triple Quadrupole Mass Spectrometer”, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (2016): 886–896.