LCMS Bioanalysis of Antibody Drugs Using Fab- Selective Proteolysis nSMOL - Part 4 - Multiplex Analysis -

Význam tématu

Multiplexní kvantifikace monoklonálních protilátek je klíčová pro farmakokinetické studie a monitorování kombinovaných léčebných režimů. Metoda nSMOL umožňuje cílenou proteolýzu Fab fragmentů, což usnadňuje analýzu různých protilátek v jediném běhu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat schopnost technologie nSMOL provádět simultánní LC-MS/MS analýzu tří protilátek (brentuximab vedotin, rituximab, cetuximab) a ověřit citlivost, přesnost a opakovatelnost metody podle mezinárodních validačních směrnic.

Použitá metodika a instrumentace

Pro selektivní štěpení Fab fragmentů byly využity nanoparticle s navázaným trypsinem (nSMOL). Universální protokol přípravy vzorků zahrnoval:

• Odsátí IgG frakce z plazmy pomocí Fc regionů
• Proteolýzu Fab fragmentů na povrchu trypsinových nanopartikel

Analytické podmínky LC-MS/MS:

• LC: Nexera X2 s kolonou Shim-pack GISS C18 (50×2,1 mm), teplota 50 °C
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, fáze B: 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu
• Gradient: 1 % B po 1,5 min → 42 % B po 4 min → 95 % B po 1 min → návrat na 1 % B po 1 min
• Průtok: 0,4 mL/min, injekce 10 µL
• MS: LCMS-8050/8060, ESI pozitivní, DL 250 °C, Heat Block 400 °C, Interface 300 °C, nebulizační plyn 3 L/min, sušící plyn 10 L/min, ohřívací plyn 10 L/min

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla lineárního rozsahu 0,58–300 µg/mL v lidské plazmě. Přesnost se pohybovala mezi 91,5 % a 115 % a preciznost mezi 4,4 % a 11,8 % CV, což splňuje kritéria FDA a Japonského ministerstva. MRM chromatogramy potvrdily dobrou separaci a citlivost pro všechny tři protilátky. Při koncentracích 1,76 a 240 µg/mL byla dosažena CV pod 10 % a přesnost nad 97 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nSMOL nabízí:

• Simultánní sledování více protilátek v jednom běhu
• Univerzální přípravu vzorků nezávislou na konkrétním typu protilátky
• Využití od preklinických až po klinické studie
• Zrychlení vývoje bioanalytických metod

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření počtu analyzovaných protilátek, automatizace přípravy vzorků a začlenění do vysokoprůchodových farmakokinetických a farmakodynamických studií. Metoda má potenciál v personalizované medicíně a monitorování kombinovaných terapií.

Závěr

Technologie nSMOL v kombinaci s LC-MS/MS poskytuje robustní, citlivou a validovanou metodu pro multiplexní kvantifikaci protilátek. Splňuje regulační požadavky a usnadňuje bioanalýzu v různých fázích vývoje léčiv.

Reference

• Iwamoto N. et al. Analyst, 2014, DOI:10.1039/c3an02104a
• Iwamoto N. et al. Clinical Pharmacology & Biopharmaceutics, 2016, DOI:10.4172/2167-065X.1000164