LCMS Bioanalysis of Antibody Drugs Using Fab-Selective Proteolysis nSMOL- Part 2 - Bevacizumab analysis

Význam tématu

Vývoj a validace analytických metod pro monoklonální protilátky je zásadní pro spolehlivou kvantifikaci těchto bioterapeutik v preklinickém a klinickém prostředí, stejně jako pro QA/QC v průmyslu. Metoda nSMOL umožňuje selektivní proteolýzu Fab fragmentu protilátek, čímž minimalizuje interferenci s endogenními proteiny a zjednodušuje vývoj bioanalytických assay.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na optimalizaci a validaci LC-MS/MS metody pro kvantitativní stanovení Bevacizumabu v lidské plasmě pomocí technologie nSMOL. Hlavním cílem bylo prokázat splnění kritérií přesnosti, reprodukovatelnosti a stability dle farmaceutických směrnic pro bioanalytické metody.

Použitá metodika a instrumentace

Výchozím bodem je nSMOL Antibody BA Kit pro selektivní proteolýzu variabilní části protilátek. Po redukci, alkylaci a proteolýze je vzorek analyzován pomocí:

• LC systém Shimadzu Nexera X2 s kolonkou Shim-pack GISS C18 (50×2,1 mm) při 50 °C
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, fáze B: 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu; gradient 1 % B po 1,5 min, následně na 35 % B do 5 min, až 95 % B v 6,5 min a návrat na 1 % B
• MS detekce na Shimadzu LCMS-8050/8060, ESI pozitivní ionizace, rozhraní 300 °C, rozprašovač 3 L/min, sušící plyn 10 L/min, blok 400 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Byly identifikovány tři klíčové kvantitační peptidy (P14R, FTFSLDTSK, VLIYFTSSLHSGVPSR) z oblasti CDR2. Metoda vykázala lineární rozsah 0,15–300 μg/ml, průměrnou přesnost 101,3 % a opakovatelnost (CV) pod 12 %. Stabilitní testy (freeze-thaw, dlouhodobá stabilita a stabilita po 48 h při 5 °C) potvrdily zachování přesnosti nad 89 %.

Přínosy a praktické využití metody

nSMOL workflow poskytuje jednotný protokol pro různé monoklonální protilátky bez nutnosti zásadních úprav. Díky vysoké selektivitě, splnění validačních standardů a širokému dynamickému rozsahu je metoda vhodná pro preklinické i klinické studie, multiplexní kvantifikaci a rutinní QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní analýza více terapeutických protilátek v jednom běhu
• Automatizace přípravy vzorků pro zvýšení throughputu
• Integrace do klinických farmakokinetických platforem a diagnostických aplikací
• Rozšíření protokolu na bispecifické a modifikované protilátky

Závěr

Technologie nSMOL v kombinaci s LC-MS/MS poskytuje robustní, validovanou a vysoce selektivní přístup k bioanalýze monoklonálních protilátek. Pro Bevacizumab byla metoda plně validována v souladu s doporučeními farmaceutických úřadů a prokázala potenciál pro široké uplatnění v preklinických i klinických studiích.

Reference

• Iwamoto N et al. Analyst, 2014, DOI:10.1039/c3an02104a
• Iwamoto N et al. Drug Metab Pharmacokinet., 2016, DOI:10.1016/j.dmpk.2015.11.004