Shimadzu Solutions for Biopharmaceutical - Application Notebook

Význam tématu

Pro bioanalýzu monoklonálních protilátek je klíčové dosáhnout vysoké specificity, citlivosti a opakovatelnosti v přímé kvantifikaci protilátkových léků v komplexních biologických matricích (plazma). Tradiční ELISA metody trpí zkříženou reaktivitou a interferencí, zatímco LC–MS/MS přináší strukturálně indikované měření, které však vyžaduje selektivní přípravu vzorku pro zachování rozhraní ESI.

Cíle a přehled studie / článku

Články popisují nSMOL Antibody BA Kit – unikátní přístup založený na selektivní proteolýze regionu Fab monoklonálních protilátek. Cílem je zavést univerzální vzorkovací protokol použitelný pro různé protilátkové léky (trastuzumab, bevacizumab, nivolumab) i multiplexní analýzu a prokázat splnění validačních kritérií dle japonských a FDA směrnic.

Použitá metodika a instrumentace

Princip nSMOL:

• Sběr IgG frakcí z plazmy pomocí selektivní pryskyřice (Immunoglobulin collection resin)
• Selektivní proteolýza regionu Fab na povrchu nanopartiklí s immobilizovaným trypsinem (FG beads Trypsin DART)
• Fab-signature peptidy jsou obohaceny a následně kvantifikovány LC–MS/MS metodou MRM

Instrumentace:

• LC: Nexera X2 / Nexera-i
• Kolony: Shim-pack GISS C18, Aeris Peptide XB-C18, Shim-pack MAYI
• MS: Triple kvadrupólové LCMS-8050 / 8060, ESI positive režim

Hlavní výsledky a diskuse

Pro každou protilátku byl identifikován optimální signature peptid z CDR oblasti, stanoven MRM přechod a ověřena validační kritéria:

• Trastuzumab: kvantifikační rozsah 0,06–250 μg/mL, průměrná přesnost ~100 %, CV < 9 %
• Bevacizumab: rozsah 0,15–300 μg/mL, přesnost ~101 %, CV < 12 %
• Nivolumab: rozsah 0,15–300 μg/mL, přesnost ~100 %, CV < 8 %
• Multiplexní analýza 3 protilátek (brentuximab vedotin, rituximab, cetuximab): rozsah 0,58–300 μg/mL, CV 4,4–11,8 %, přesnost 91,5–115 %

nSMOL zajistil krátký čas přípravy, nízkou interferenci matrice a jednotný protokol pro preklinické i klinické vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzálnost: jeden protokol aplikovatelný na široké spektrum monoklonálních protilátek
• Selektivita: Fab-selektivní proteolýza eliminuje interferenci z endogenních IgG
• Rychlost a robustnost: zkrácená doba přípravy a vysoká opakovatelnost
• Multiplexní PK monitorování: detekce více protilátek v jedné analýze

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření nSMOL na další biologické léky (bispecifické protilátky, fúzní proteiny)
• Integrace s automatizovanou vzorkovou přípravou a high-throughput platformami
• Vylepšené datové nástroje pro selektivní analýzu komplexních glykozylovaných proteinů
• Implementace do regulovaných klinických studií a procesů QA/QC podle nejnovějších bioprodiskových směrnic

Závěr

nSMOL Antibody BA Kit představuje průlomový přístup k bioanalýze monoklonálních protilátek, který kombinuje Fab-selektivní proteolýzu s vysoce citlivou LC–MS/MS analýzou. Metoda splňuje přísné validační požadavky, je adaptabilní na různé protilátkové léky a usnadňuje multiplexní monitorování farmakokinetiky od preklinického až po klinické prostředí.

Reference

• Iwamoto N et al. Analyst, 2014, DOI:10.1039/c3an02104a
• Iwamoto N et al., Anal Methods, 2015, DOI:10.1039/c5ay01588j
• Iwamoto N et al., Drug Metab Pharmacokinet., 2016, DOI:10.1016/j.dmpk.2015.11.004
• Iwamoto N et al., J Chromatogr B, 2016, DOI:10.1016/j.jchromb.2016.04.038
• Iwamoto N et al., Clin Pharmacology & Biopharmaceutics, 2016, DOI:10.4172/2167-065X.1000164