A Combined MRM and SIM Method for Direct Quantitative Determination of Amino Acids in Various Samples on LC/MS/MS

Význam tématu

Analýza aminokyselin hraje klíčovou roli v biomedicíně, potravinář ském výzkumu i výrobě nutričních doplňků. Přesná a rychlá kvantifikace umožňuje sledovat metabolické změny, kvalitu surovin a bezpečnost produktů. Odstranění nutnosti chemické derivatizace usnadňuje workflow, snižuje časovou náročnost i náklady na analýzu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zavedení a ověření kombinované metody MRM a SIM pro přímou kvantitativní stanovení 20 aminokyselin na LC/MS/MS bez pre- ani post-kolonkové derivatizace. Metoda byla testována na biologických vzorcích (plasma, sérum, moč) i nápojích (vína, pivo, ocet, sportovní voda a amino acid drink).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly vyproteinizovány přídavkem směsi methanol/acetonitril (1:1) v poměru 1:3 nebo 1:4, poté vířeny a odstřeďovány. Supernatant byl filtrován a injektován do LC/MS/MS systému Shimadzu LCMS-8040 spojeného s UFLC XR. Jako analytická kolona sloužila Intrada Amino Acid (100×3 mm, 3 μm) s gradientním elučním režimem při 35 °C a průtoku 0,6 mL/min. Mobilní fáze A: ACN/THF/ammonium formiát/kyselina formiová (75/9/16/0,3, obj.); B: ACN/ammonium formiát (20/80, obj.). Ionizace ESI v pozitivním režimu, detekce v kombinovaném režimu MRM-SIM zvýšila citlivost zejména pro glycin.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje lineárního rozsahu 0,1–100 nmol/mL (R2 >0,99) a LOQ pro většinu aminokyselin na úrovni 0,1–1 nmol/mL. Výjimkou je glycin, jehož LOQ v režimu MRM činilo 25 nmol/mL, zatímco v SIM lze stanovit až 5 nmol/mL. Opakovatelnost metodiky (%RSD) byla lepší než 5 %. Při analýze vzorků:

• v plazmě a séru převládají glutamát a alanin,
• v moči se výrazně liší profily mezi jedinci, nejkonzistentnější jsou glutamin a prolin,
• ve víně jsou aminokyseliny přítomny ve vyšších koncentracích kromě tryptofanu a cystinu,
• v pivu dominuje prolin, cystin bývá na hranici detekce,
• sportovní voda a nápoj s aminokyselinami vykazují hodnoty v souladu s deklarací výrobce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje přímou analýzu bez derivatizace, šetří čas a náklady, minimalizuje riziko vzniku artefaktů. Kombinovaný režim MRM-SIM zajišťuje vysokou citlivost, spolehlivost a robustnost v širokém spektru vzorků. Uplatnění nachází v klinické diagnostice, potravinářském průmyslu, farmaceutickém výzkumu i kontrole kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření technologie pro metabolomické studie s vysokou propustností, integrace automatizovaných přípravných stanic a datových platforem pro zpracování komplexních dat. Vývoj nových stacionárních fází a vícerozměrná chromatografie slibují zvýšení rozlišovací schopnosti. Pokročilé hmotnostní spektrometry s vyšším rozlišením posunou citlivost a selektivitu stanovení aminokyselin i peptidů.

Závěr

Popsaná kombinovaná metoda MRM a SIM na LC/MS/MS s použitím Intrada Amino Acid kolony umožňuje rychlou, přesnou a citlivou kvantifikaci 20 aminokyselin v různorodých matricích bez derivatizace. Validace prokázala vynikající linearitu, opakovatelnost a robustnost, což zdůrazňuje praktickou hodnotu metody v mnoha oblastech analytické chemie.

Reference

1. Yazawa I., Tachikawa H. Development of a novel amino acids analysis column for LC-MS without derivatization. Imtakt Corporation, 2014.
2. Matsumoto K., Watanabe J., Yazawa I. Simultaneous quantitative analysis of 20 amino acids in food samples without derivatization using LC-MS/MS. ASMS 2014, TP 510.