Determination of Unbound Urinary Amino Acids Incorporated with Creatinine Normalization by LC-MS/MS Method with CLAM-2000 Online Sample Pre-treatment

Význam tématu

Profil volných aminokyselin v moči slouží jako citlivý marker metabolických poruch, poruch transportu AMK a hodnocení příjmu bílkovin. Normalizace na kreatinin zohledňuje variace hydratace a umožňuje srovnání mezi vzorky.

Cíle a přehled studie

Cílem byla konstrukce plně automatizované LC-MS/MS metody bez derivatizace pro kvantifikaci 22 volných aminokyselin a kreatininu v lidské moči. Metoda využívá on-line předúpravu vzorků CLAM-2000 spojenou s triple kvadrupólovým spektrometrem LCMS-8040.

Použitá instrumentace

• Shimadzu CLAM-2000 – automatizovaný modul pro předúpravu vzorků
• Shimadzu LCMS-8040 – triple kvadrupólový LC-MS/MS systém
• Intrada Amino Acid kolona (100×3 mm, 3 µm)
• ESI ionizační rozhraní, pozitivní MRM režim, SIM pro glycin

Použitá metodika

Vzorky moči (40 µl) byly smíchány s organickým rozpouštědlem (MeOH/ACN) a vnitřními standardy (Phe-d5, Ser-d3), promíchány a vakuově filtrovány. Následovala automatická injekce (5 µl) do LC s gradientem na bázi ACN, THF a formiátových pufrů. Kvantifikace probíhala pomocí MRM s osmiúrovňovou kalibrační řadou (0,1–100 µM).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající linearitu (R2 > 0,99), LOQ pod 1 µM a přesnost 89–113 % s opakovatelností pod 17 % RSD. Plná automatizace zkracuje dobu přípravy na 3–5 minut na vzorek. Analýza 28 vzorků od zdravých dobrovolníků odhalila variabilitu celkových AMK (543–16 640 µM) a kreatininu (438–2 261 µM). Normalizovaný ukazatel TCNA umožnil rozdělit vzorky do skupin s odlišnými profily AMK; významnost rozdílů potvrdilo p < 0,05 a PCA analýza.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a plně automatizovaná předúprava vzorků
• Bez derivatizace, šetřící čas a chemikálie
• Vysoká přesnost a citlivost vhodná pro klinické i výzkumné aplikace
• Standardizovaná normalizace kreatininem pro robustní srovnání mezi vzorky

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na diagnostiku metabolických onemocnění a nutričního stavu, integrace do rutinních klinických laboratoří a kombinace s analýzou dalších metabolitů. Využití pokročilých multivariačních a strojově-učících přístupů k prediktivnímu profilování.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda s on-line předúpravou CLAM-2000 poskytuje rychlou, citlivou a automatizovanou analýzu volných aminokyselin normalizovaných na kreatinin. Metoda je vhodná pro vysokoprůchodové biomarkerové studie a klinickou praxi.

Reference

1. Mcmenamy RH, Lund CC, Oncley JL. J Clin Invest. 1957;36(12):1672.
2. Cocker J, Mason HJ, Warren ND, Cotton RJ. Occup Med. 2011;61:349–353.
3. Hou H et al. J Anal Methods Chem. 2012;2012:1–8.
4. Derezinski P et al. Int J Med Sci. 2017;14(1):1–12.
5. Sun Z et al. ASMS 2016, TP 740.