Non-Derivatization LC/MS/MS Method for Determination of Amino Acids in Infant and Adult Nutritional Formulas Following AOAC Requirements

Význam tématu

Proteiny a jejich aminokyseliny jsou klíčové složky dětských a dospělých výživových formulí. Kvalitní a rychlá analýza proteinogenních aminokyselin a taurinu se uplatňuje v průmyslové kontrole kvality, výzkumu i regulaci výživových produktů. Metody bez chemické derivatizace zkracují dobu analytického postupu, omezují riziko chyb vzniklých derivatizační chemii a usnadňují akreditaci laboratoří.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na validaci nederaivizační LC/MS/MS metody pro kvantifikaci 18 proteinogenních L-α-aminokyselin a taurinu v standardních referenčních materiálech (SRM NIST® 1849a) a v komerčních práškových formulích. Byla porovnána tři hydrolyzní procedury a optimalizovány podmínky pro dosažení přesnosti a opakovatelnosti v souladu s požadavky AOAC.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolona: Intrada Amino Acid Column, 100 mm x 3 mm I.D., 3 µm
• Mobilní fáze A: ACN/THF/25 mM HCOONH4/HCOOH (9/75/16/0.3), B: ACN/100 mM HCOONH4
• Gradient: 0 % B (0–3 min) → 17 % B (9 min) → 100 % B (16–18 min) → 0 % B (18.1 min) → stop (21 min)
• Průtok: 0.6 mL/min, teplota 35 °C, objem injekce 3 µL
• Spectrometr: LCMS-8045, HESI, MRM v pozitivním/negativním módu
• Teploty: rozptylové (DL) 250 °C, bloková 400 °C, ESI 300 °C
• Gázy: Ar pro CID (230 kPa), dusík (N2) pro nebulizaci a sušení, Zero Air pro ohřev

Proti klasickým derivatizačním HPLC metodám se hydrolyzovaly vzorky pomocí:

• Metoda 1 – kyselina chlorovodíková a propionová, 160 °C 1 h
• Metoda 2 – alkalická hydrolýza 4 N NaOH, 195 °C 1 h (Tyrp)
• Metoda 3 – pre-oxidace performovou kyselinou + kyselina chlorovodíková (Cys/Cyst)

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla lineární kalibrační křivky v rozsahu 0.1–50 µM s vysokou přesností (recovery 70–138 %) a opakovatelností (RSD <5 %). U SRM NIST 1849a odpovídaly výsledky většiny aminokyselin referenčním hodnotám, kromě alaninu (recovery 26 %). Optimalizace hydrolyzy ukázala, že 1 h kyselé hydrolýzy a 1 h alkalické hydrolýzy při 195 °C zajišťují maximální výtěžek. U komerčních vzorků byl pozorován dvojnásobný obsah aminokyselin v dospělých formulích oproti dětským, přičemž nejvyšší koncentrace měly glutamát, lysin a aspartát.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby analýzy a zjednodušení preparace díky absenci derivatizace
• Vysoká citlivost a selektivita MRM inkluzí 20 analytů najednou
• Možnost rutinní kontroly kvality v potravinářských provozech a výzkumných laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda je vhodná k rozšíření o neuplatněné aminokyseliny, peptidové fragmenty či metabolity. Vývoj multi-analyzátorů a online vzorkování může dále zrychlit monitoring živin v průmyslu. Kombinace s vysokorozlišovacími hmotovými spektrometry umožní doplnění neznámých aminokyselin a modifikací.

Závěr

Non-derivatizační LC/MS/MS metoda pro analýzu 18 aminokyselin a taurinu prokázala vhodnost k rutinní kvantifikaci v nutrientních formulích. Metoda splňuje požadavky AOAC, je rychlá, reprodukovatelná a snadno implementovatelná bez náročné derivatizace.

Reference

• Standard Method Performance Requirements for Determination of Amino Acids in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula, AOAC SMPR 2014.013
• Spindler M., Stadler R., Tanner H., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1984, 32, 1366–1371
• Sun Z., Xing J., Khoo P.Y., Zhan Z., ASMS 2016, Poster TP 740