Development and Validation of Non-derivatization LC/MS/MS Method for Fast Determination of Proteinogenic Amino Acids in Fish

Význam tématu

Analýza proteinogenních aminokyselin v rybách je klíčová pro hodnocení nutriční kvality i monitorování zdravotních parametrů produktů. Rychlé stanovení bez nutnosti derivatizace zkracuje dobu analýzy a snižuje složitost přípravy vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat LC/MS/MS metodu založenou na MRM režimu pro kvantifikaci 20 proteinogenních aminokyselin a taurinu v hydrolyzovaných rybích vzorcích bez derivatizace. Metoda byla srovnána s konvenční UHPLC s fluorescenční detekcí vyžadující derivatizaci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky rybího masa (red snapper, seabass, španělský makrel) byly hydrolyzovány v kyselině chlorovodíkové a propionové při 160 °C s optimalizovanou dobou 30 min. Po odparku se provedlo odmaštění hexanem, ředění 400× a filtrace 0,2 µm. Analýza probíhala na Imtakt mixed-mode kolóně (100×3 mm, 3 µm) s gradientním eluentem na bázi acetonitrilu, THF a formiátu amonného. Detekce probíhala na Shimadzu LCMS-8060 ve MRM režimu pro většinu aminokyselin a v SIM režimu pro glycin.

• Uzavřená hydrolyza: HCl/propionová kyselina 1:1, 160 °C, 30 min
• Odmaštění hexanem, ředění a filtrace
• Chromatografie: Imtakt mixed-mode, 0,6 mL/min, teplota 40 °C, runtime 15 min
• MS/MS: Heated ESI, MRM (+/–), CID Ar 270 kPa

Hlavní výsledky a diskuse

Pro všech 20 aminokyselin byly získány kalibrační křivky s liniaritami R² > 0,995 (arginin 0,995). LOQ se pohybovalo v rozmezí 0,004–0,10 µM, u glycinu 5 µM. Reprodukovatelnost (RSD) byla < 8 % u většiny složek. Matricové efekty byly kompenzovány post-spikingem. Hydrolyza za 30 min poskytla maximální výtěžky aminokyselin s výjimkou lysinu. Obsah esenciálních aminokyselin v rybách se pohyboval mezi 8,7 a 11,6 g/100 g, nižší úroveň tryptofanu vyžaduje alkalickou hydrolyzu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda výrazně zrychluje přípravu vzorku i analýzu díky eliminaci derivatizace a krátké době hydrolyzy. Je vhodná pro rutinní kontrolu kvality potravin, výživová hodnocení a průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další automatizace a online integrace hydrolyzy, rozšíření na různé matrice, zavedení alkalické hydrolyzy pro stabilní stanovení tryptofanu a kombinace s high-throughput platformami pro komplexní nutriční analýzy.

Závěr

Předložená LC/MS/MS metoda nabízí rychlé, přesné a reprodukovatelné stanovení proteinogenních aminokyselin a taurinu v rybích vzorcích bez derivatizace a srovnatelné výsledky s UHPLC-RF.

Reference

1. European Pharmacopoeia 5.0, 2.2.56 Amino Acid Analysis
2. Bimal Mohanty et al., Amino Acid Compositions of 27 Food Fishes and their Importance in Clinical Nutrition, Journal of Amino Acids 2014
3. Imtakt Technical Report T1734E
4. Matsumoto K., Watanabe J., Yazawa I., ASMS 2014 TP 510