Direct Determination of Plasma Free Amino Acids by Combined MRM-SIM Method on LC/MS/MS

Význam tématu

Volné aminokyseliny v plazmě a séru jsou klíčové endogenní metabolity používané jako indikátory onemocnění a biomarkerů nádorových onemocnění. Přesné a citlivé stanovení jejich koncentrací je důležité pro klinickou diagnostiku, výzkum a průmyslové aplikace v QA/QC.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje vývoj a validaci metody pro přímé stanovení 20 geneticky kódovaných volných aminokyselin v lidské plazmě a séru pomocí LC/MS/MS bez nutnosti prekolonové derivatizace. Metoda kombinuje režim MRM pro většinu aminokyselin a režim SIM pro zvýšení citlivosti glycin.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byla použita chromatografická sestava LCMS-8040 (triple quadrupol) v kombinaci s UHPLC systémem UFLCXR a speciálním sloupcem Amino Acid column (100 x 3 mm, 3 μm). Mobilní fáze A: ACN/THF/25 mM amonium formiát/formová kyselina (9/75/16/0.3) a B: ACN/100 mM amonium formiát (20/80). Gradient eluce byl optimalizován pro efektivní rozdělení všech analyzovaných aminokyselin. Vzorky plazmy a séra byly deproteinovány směsí methanol-aketonitril (50:50) v poměru 3:1, odstředěny a filtrovány injekční stříkačkou (0,2 μm). Metodu kvantifikace tvořilo 19 kanálů MRM doplněných o jeden kanál SIM pro glycin.

Hlavní výsledky a diskuse

Limit detekce (LOD) a limit kvantifikace (LOQ) v režimu MRM dosahují hodnot 0,12–7,2 μM pro jednotlivé aminokyseliny, přičemž glycin v MRM vykazoval LOQ 528 μM, zatímco v režimu SIM byl tento limit 17,6 μM. Kalibrační křivky v rozsahu 10–100 μM vykázaly výbornou linearitu (R2 > 0,992). Přímá analýza biologických vzorků potvrdila korektní kvantifikaci všech aminokyselin kromě glycin, která vyžaduje režim SIM pro spolehlivé stanovení. Metoda prokázala dobrou reprodukovatelnost a srovnatelné výsledky mezi plazmatem a sérem. Profil aminokyselin se mírně lišil od literárních dat, zejména u Glu, Ala a Arg.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda eliminuje náročnou derivatizaci, zkracuje dobu přípravy vzorku a minimalizuje riziko chyb. Díky vysoké citlivosti a robustnosti je vhodná pro klinickou diagnostiku, výzkum onkologických biomarkerů, nutriční studie a průmyslovou kontrolu jakosti léčiv či potravin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na další biochemické analyty (citrulin, ornitin, kreatinin) umožní komplexnější metabolomické profily. Integrace s vysoce přesnou hmotnostní spektrometrií, automatizovaná příprava vzorků a pokročilá datová analýza (strojové učení) podpoří personalizovanou medicínu a velkoplošné screeningové programy.

Závěr

Vyvinutá kombinovaná MRM-SIM metoda s využitím LCMS-8040 a specializovaného sloupce umožňuje rychlou, citlivou a spolehlivou kvantifikaci 20 volných aminokyselin v lidské plazmě a séru bez derivatizace. Postup nabízí významné časové i finanční úspory při zachování vysoké analytické kvality.

Reference

• McMenamy R.H., Lund C.C., Oncley J.L. Unbound amino acid concentrations in human blood plasmas. J Clin Invest. 1957;36(12):1672–1679.
• Shingyoji M. et al. The significance and robustness of a plasma free amino acid (PFAA) profile-based multiplex function for detecting lung cancer. BMC Cancer. 2013;13:77.
• Leichtle A.B. et al. Serum amino acid profiles and their alterations in colorectal cancer. Metabolomics. 2012;8:643–653.
• Yazawa I., Tachikawa H. Development of a novel amino acids analysis column for LC-MS without derivatization. Imtakt Corp. 2014.
• Matsumoto K., Watanabe J., Yazawa I. Simultaneous quantitative analysis of 20 amino acids in food samples without derivatization using LC-MS/MS. ASMS 2014, TP 510.