Agilent BioHPLC Column Selection Guide

Význam tématu

Různorodé biomolekuly od malých peptidů, oligonukleotidů až po velké proteiny a monoklonální protilátky vyžadují specializované kolony a podmínky chromatografie pro spolehlivou a reprodukovatelnou analýzu. V biotechnologii a farmaceutickém průmyslu je klíčové přesně charakterizovat primární strukturu, varianty nabití, agregaci, glykosylaci i množství cílového proteinu (titer), aby bylo zajištěno bezpečné a účinné podání bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje kompletní průvodce výběrem kolony Agilent BioHPLC pro různé typy biomolekul a analytických úloh. Popisuje:

• kriterium volby kolon podle velikosti a vlastností analyzované molekuly,
• přehled instrumentace Agilent (1260 Bio-inert Quaternary LC a 1290 Infinity),
• hlavní metody: reverzní fáze, iontově chromatografie (IEX), velikostně vylučující chromatografie (SEC), HILIC pro glykany, afinitní kolony pro Protein A a MARS.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC – plně biovzdorná cesta vzorku, pH 1–13, až 600 bar
• Agilent 1290 Infinity Binary/Quaternary LC – ultra VHPLC až 1200 bar, přesné míchání pufrů, ISET
• Agilent 1260 Infinity HPLC s DAD a multi-detektory pro SEC/UV/LS
• Agilent 6224 Accurate‐Mass TOF MS pro glykopeptidy a peptidy

Některé klíčové kolonové formace:

• AdvanceBio RP‐mAb (450 Å, C4/SB‐C8/Diphenyl) – rychlá a vysoce rozlišená RP analýza mAb
• ZORBAX RRHD 300 Å (1.8 µm) – UHPLC RP separace intactní a fragmentovaných proteinů
• Poroshell 300 (300 Å, 5 µm) – SRP pro peptidy a bílkoviny s velmi krátkými časy
• AdvanceBio Peptide Mapping (120 Å, 2.7 µm) – vysoce efektivní UHPLC peptidové mapy
• PLRP‐S a PL‐SAX/PL‐SCX (100–4000 Å) – polymerní kolony pro rP a IEX oligonukleotidů a proteinů
• Bio IEX a Bio mAb (PS/DVB, různé funkční skupiny) – IEX pro isoformy mAb a proteiny
• Bio SEC‐3/5 (100–2000 Å) – SEC pro agregaci a fragmentaci proteinů
• AdvanceBio Glycan Mapping (1.8/2.7 µm) a ZORBAX HILIC – analýza N‐glykanů a glycopeptidů
• Bio‐Monolith Protein A – rychlá afinitní kolona pro kvantifikaci IgG z buněčných kultur
• MARS (Human/Mouse) – imunodepletory pro odstranění vysoce abundantních proteinů z plazmy

Hlavní výsledky a diskuse

Reverzní fáze RP‐mAb a RRHD 300 Å zajistily separaci intactních i redukovaných mAb pod 2 minuty a rozlišení jemných modifikací.

Ion‐exchange Bio mAb a Bio IEX umožnily detailní analýzu nabitých variant i C‐terminálních forem v řádu minut.

SEC Bio SEC‐3 poskytuje vyšší rozlišení dimerů/monomerů oproti klasickým kolonaám při kratších časech.

HILIC kolony AdvanceBio a ZORBAX ukázaly rychlou a vysoce rozlišenou separaci N‐glykanů (analýza pod 10 min), identifikaci a kvantifikaci glykoforms.

Protein A Bio‐Monolith a MARS systémy významně zkrátily dobu stanovení titru protilátek a umožnily snížit složitost svazku při analýze plazmy.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlení analýzy mAb a proteinů snížením doby běhu 2–3× s RRHD 1.8 µm a Poroshell 300
• Zvýšení rozlišení při analýze agregátů a nabitých forem použitím SEC 3 µm a IEX 1.7 µm
• Vyšší citlivost LC/MS pro peptidy i oligonukleotidy díky optimalizovaným kolonaám a volatilním pufrům
• Spolehlivá kvantifikace glykanů v biotherapeuticích při zkrácené přípravě vzorku
• Automatizované stanovení titru protilátek a deplece vzorků plazmy pro biomarkerové studie

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dvojdimenzionální LC (2D‐LC) kombinující IEX×UHPLC RP pro plnou charakterizaci mAb
• Rozšířené použití monolitických sloupců pro rychlou offline a online frakcionaci proteinů a DNA
• Integrace vysoce rozlišených SEC/LS/MS pro kvantitativní profil agregátů v reálném čase
• Nové silikagelové a polymerní materiály s rozšířenou pH stabilitou a selektivitou
• Vznik nových nadzorovaných QC pracovních postupů pro kompletní charakterizaci biotherapeutik

Závěr

Komplexní portfólio kolona a metod Agilent BioHPLC poskytuje flexibilní, rychlá a vysoce rozlišená řešení pro analýzu peptidů, proteinů, protilátek, oligonukleotidů a glykanů. Optimalizované sloupce na bázi super‐porózních, polymerních i monolitických materiálů společně s robustními LC systémy umožňují zvýšit produktivitu i kvalitu dat v celé škále biotechnologických a farmaceutických aplikací – od metod developmentu po rutinní QC.