Don’t Lose It: Getting Your Peaks in Shape - Choosing columns and conditions for thebest peak shape

Význam tématu

V kapalinové chromatografii je kvalita tvaru vrcholu klíčová pro přesnou identifikaci a kvantifikaci analytů. Symetrické, užší vrcholy s hodnotou tailing faktoru blízkou 1, vysokou účinností a malší šířkou vedou k lepší rozlišitelnosti, citlivosti a reprodukovatelnosti měření a zároveň prodlužují životnost kolony.

Cíle a přehled studie / článku

Tento materiál se zabývá definicí optimálního tvaru vrcholu, metodami jeho měření, nejčastějšími problémy s tvarem vrcholu, faktory, které jej ovlivňují, a praktickými doporučeními pro dosažení co nejlepších výsledků v HPLC analýzách.

Použitá metodika a instrumentace

Metody měření tvaru vrcholu:

• USP tailing faktor při 5 % výšky vrcholu
• Asymetrický faktor při 10 % výšky vrcholu
• Počet plat platiny (N) a šířka vrcholu ve výšce poloviny maxima
• Van Deemterova analýza závislosti výšky platiny na lineární rychlosti

Faktory testované v příkladech:

• Typ a kvalita siliky, povrchová úprava (endcapping, embedded groups)
• Pórovitost a velikost částic (totálně vs. superficially porous)
• pH a složení mobilní fáze (pufry, organické modifikátory, přísady jako TEA, TFA)
• Rozměry kapilár, kvalitní fitinky (InfinityLab Quick Connect/Quick Turn)
• Nastavení detektoru (doba odezvy, objem flow cell)
• Kvalita vzorku (rozpouštědlo, přetížení, nečistoty, komplexace kovů)

Použitá instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II, 1200/6410 LC/MS/MS, 1100 DAD
• InfinityLab Poroshell 120 HPH-C18, Poroshell 300SB-C18, ZORBAX Rx-SIL, Eclipse Plus C18, StableBond, Extend-C18, Bonus-RP, XDB-C8
• Max-Light a RFID senzorem vybavené lampy a flow cells

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo prokázáno, že nejčistší silika s minimem kyselých silanolů (Rx-SIL, SB-Sil) výrazně zlepšuje tvar vrcholu u zásaditých sloučenin. Dvojité či trojité endcappingy a vložené polární skupiny účinně snižují interakce s volnými silanoly. Zvyšující se koncentrace pufru (20–50 mM) a volba vhodného pH (pro zásady i kyseliny) stabilizuje retenci a snižuje tailing. Typ organického modifikátoru (ACN vs. MeOH) a přísady (TEA pro zásadité, TFA či acetic acid pro kyselé analyt) dále optimalizují tvar. Superficially porous částice Poroshell nabízejí vysokou účinnost při vyšších průtocích, což umožňuje rychlejší separace peptidů a proteinů. Nadměrný objem kapiláry či nevhodné fitinky vede k významnému rozšíření vrcholů. Kontaminace kolony nečistotami nebo kovy lze odstranit kyselinovým proplachem.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný tvar vrcholu zlepšuje kvantitativní přesnost, rozlišovací schopnost a stabilitu metod. V praxi to znamená spolehlivější analytické výsledky, kratší časy analýz, nižší provozní náklady a delší životnost chromatografických kolon.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj hybridních a stabilních vysokopH materiálů (HPH C18) pro širší rozsah analýz
• Pokročilé povrchové úpravy zabraňující adsorpci kovů a nečistotám
• Rozšíření superficially porous technologie pro biopolymerní a vysokomolekulární separace
• Automatizace sledování stavu spotřebního materiálu (RFID, IoT) pro prediktivní údržbu
• Nasazení strojového učení pro optimalizaci podmínek v reálném čase

Závěr

Správná volba chromatografické kolony, mobilní fáze, systémových komponent a vzorkové přípravy vede k optimálnímu tvaru vrcholu. Dodržení doporučených postupů (endcapping, vhodné pH, pufry, fitinky, objem kapiláry, čištění) zaručuje vyšší kvalitu, reprodukovatelnost a efektivitu HPLC metod.

Reference

Žádné literární odkazy ve vstupním materiálu nebyly uvedeny.