Precise Quantitative Serum LC-MS/MS Profiling: The Impact of Sample Preparation and Sample Source on Biomarker Discovery Studies

Význam tématu

Serový proteom představuje komplexní zdroj proteinových biomarkerů pro diagnostiku a monitorování onemocnění. Kvantitativní LC-MS/MS analýza séra umožňuje odhalit změny v koncentracích proteinů, které mohou indikovat patologické procesy. Klíčem k úspěšnému objevu a validaci biomarkerů je minimalizovat analytickou i preanalytickou variabilitu a dosáhnout dostatečné hloubky proteomického pokrytí.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na zhodnocení vlivu různých postupů přípravy a zdrojů vzorků na přesnost a hloubku kvantitativního profilování sérových proteinů pomocí LC-MS/MS. Cílem bylo:

• Stanovit úroveň analytické a biologické variability při rutinních low-flow LC-MS metodách.
• Ověřit, jak odlišné podmínky srážení a zpracování vzorků v různých laboratořích ovlivňují identifikaci regulovaných proteinů.
• Ukázat potenciál online 2D low-flow LC-MS/MS pro hluboké proteomické profilování séra.
• Porovnat výsledky na úrovni skupin a individuálních vzorků s ohledem na budoucí využití v přesné medicíně.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky séra byly odebrány v třech centrech s různými procedurami srážení (doba a teplota), odstředění a podmínkami skladování. Standardizované low-flow LC-MS metodiky zahrnovaly:

• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano systém
• Thermo Scientific Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap hmotnostní spektrometr
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 v online 2D konfiguraci s PepSwift monolitickou kolonkou (1. dimenze) a C18 kolonkou 75 μm × 150 mm (2. dimenze)

Hlavní výsledky a diskuse

Analytická variabilita low-flow LC-MS přinesla vysokou přesnost: 248 kvantifikovaných proteinů při 1% FDR s 88 % proteinů RSD < 15 %. Biologická variabilita mezi zdravými jedinci byla významně vyšší než analytická, přesto téměř 80 % proteinů vykazovalo změny < 2-násobku.
V modelové „trojúhelníkové“ studii bylo detekováno 94 proteinů s > 2× změnou a 22 proteinů s > 4× změnou, z nichž 16 odpovídalo atlasu lidské krve. Výrazné odchylky u vysoce abundantních proteinů však často souvisely s artefakty přípravy vzorků.
PCA individuálních vzorků ukázala odlišné seskupení Seralab vzorků, což bylo spojeno s uvolněním proteinů z krevních buněk během srážení. Pro hlubší profilování byla proto zavedena online 2D low-flow LC-MS/MS separace s 2, 4 a 8 frakcemi, která zvýšila počet peptidek a proteinů identifikovaných lineárně s počtem frakcí.
Analýza 15 individuálních vzorků v online 2D režimu vedla k 442 kvantifikovaným proteinům na základě 3536 unikátních peptidů. Z 110 vypočtených poměrů mělo 237 proteinů alespoň jednu změnu > 2× a 151 z nich bylo mapováno na Human Blood Atlas. Regulované proteiny převážně souvisely s koagulací a nespecifickou imunitní odpovědí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda standardized low-flow LC-MS/MS je vhodná pro rutinní profilování nejhojnějších 200 proteinů a pro vývoj cílených testů s vysokou citlivostí. Přidání online 2D separace významně rozšiřuje dynamický rozsah a hloubku proteomického pokrytí, což je nezbytné pro objev nízko abundantních biomarkerů a personalizované medicíny.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace data–independent acquisition (DIA) protokolů pro ještě vyšší reprodukovatelnost a pokrytí proteomu.
• Automatizace a miniaturizace preanalytických kroků pro snížení lidského faktoru v laboratoři.
• Rozšíření 2D online separace o další orthogonální techniky (iontová výměna, HILIC) pro maximalizaci analytického výkonu.
• Využití strojového učení pro selekci kandidátních biomarkerů na základě multi-center dat a modelů přesné medicíny.

Závěr

Studie demonstrovala, že kontrola preanalytických podmínek a využití robustních low-flow LC-MS/MS metod je klíčová pro validní objevy biomarkerů. Pro hlubší a specifické profilování sérového proteomu se jeví online 2D low-flow LC-MS/MS jako perspektivní přístup pro další výzkum a klinické aplikace.

Reference

• Boychenko A., Govorukhina N., Zheng R. Precise Quantitative Serum LC-MS/MS Profiling: The Impact of Sample Preparation and Sample Source on Biomarker Discovery Studies.
• Boichenko A. et al. J Proteome Res. 2014 Nov 7;13(11):4995-5007.
• Guzel C. et al. Comparison of Targeted Mass Spectrometry Techniques with an Immunoassay: A Case Study for HSP90α. Proteomics Clin. Appl. 2018;12:e1700107.