Unlocking the plasma proteome with Evotip Pure based, standardized and scalable workflows

Význam tématu

Plazmatická proteomika umožňuje systematické zkoumání tisíců bílkovinných markerů v krvi, které odrážejí stav různých orgánů a onemocnění. Hloubkové a zároveň vysoce propustné metody jsou klíčové pro objevování a validaci biomarkerů v klinických studiích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout plně automatizované end-to-end workflow pro analýzu čisté plazmy (neat) a membránových částic (MagNet) na robotu Opentrons OT-2. Obě strategie mají zajistit vysokou citlivost, přesnost a propustnost až stovek vzorků za den.

Použitá metodika

• Neat workflow: 1 µl plazmy ředěné v jednorozměrném pufru s SDS, TCEP a CAA, Protein Aggregation Capture na hydroxy magnetických kuličkách, 4hodinová digesce LysC a Trypsinem, přímé navázání peptidů na Evotip.
• MagNet workflow: 4 µl plazmy smíchané se SAX kuličkami a pufrem, trojité navázání a praní, jednorozměrné alkylace a redukce, 4hodinová digesce, Evotip loading.
• Analýza: Evosep One 100 SPD metoda (EV1109 kolona, 40 °C) spojená s Orbitrap Astral MS, plné skeny 240 000, MS/MS DIA-NN v library-free režimu proti Uniprot human proteomu.

Použitá instrumentace

• Liquid handling robot Opentrons OT-2
• Evosep One (100 SPD metoda, EV1109 kolona)
• Orbitrap Astral mass spectrometr (Thermo Scientific)
• MagReSyn Hydroxyl a MagReSyn SAX magnetické kuličky (ReSyn Biosciences)

Hlavní výsledky a diskuse

• Neat workflow: ~1 500 proteinových skupin a >15 000 precursorů, 1 033 skupin konzistentně ve všech vzorcích.
• MagNet workflow: >5 000 proteinových skupin a ~45 000 precursorů.
• Vysoce reprodukovatelné výstupy s mediánovým CV<10 % na úrovni proteinů, technická variabilita LC-MS <4 %.
• Neat workflow pokrývá hlavně vysoce abundatní proteiny, MagNet workflow obohacuje subproteom membránových vakuol a exozomů.
• Bylo kvantifikováno 59 z 113 FDA schválených plazmatických biomarkerů (72 % s CV<20 %) a 96 z Top100 exozomálních markerů (82 % s CV<20 %).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje plně automatizované, nákladově efektivní a udržitelné zpracování až 192 vzorků do 10 hodin s minimálním objemem plazmy (5 µl pro oba workflow). Umožňuje robustní rutinní měření velkých klinických kohort a podporuje multiplexní biomarkerové studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace dalších subproteomů, rozšíření do širokých klinických studií, kombinace s multi-omics přístupy a strojovým učením pro personalizovanou medicínu. Potenciál pro pan-cancer screening a rychlé zavedení validovaných panelů v rámci klinických laboratoří.

Závěr

Popsaná end-to-end automatizovaná pipeline na OT-2 s Evosep One a Orbitrap Astral MS nabízí hluboké a citlivé profilování plazmatického proteomu. Obě workflow dosahují vysoké přesnosti, krátkého času zpracování a minimální spotřeby materiálu, což otevírá cestu k další generaci proteomických biomarkerů a jejich klinické implementaci.

Reference

1. Batth TS., Tollenaere M., Rüther P. et al. Protein Aggregation Capture on Microparticles Enables Multipurpose Proteomics Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 2019.
2. Wu CC., Tsantilas KA., Park J. et al. Mag-Net: Rapid enrichment of membrane-bound particles enables high coverage quantitative analysis of the plasma proteome. BioRxiv. 2023.
3. Tuck MK., Chan DW., Chia D. et al. Standard Operating Procedures for Serum and Plasma Collection: Early Detection Research Network Consensus Statement. J Proteome Res. 2010.
4. Alvez MB., Edfors F., Feilitzen KV. et al. Next generation pan-cancer blood proteome profiling using proximity extension assay. Nat Commun. 2023.