High-throughput plasma proteomics: A standardized and scalable workflow for quantitative protein profiling in large sample cohorts

Význam tématu

Analýza proteomu lidské plazmy je klíčová pro identifikaci nových biomarkerů onemocnění. Variabilita a široký dynamický rozsah koncentrací proteinů v krvi vyžadují robustní, vysoce průchozí a reprodukovatelnou metodu, která zajistí konzistentní výsledky napříč stovkami až tisíci vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout standardizovaný a škálovatelný pracovní postup pro kvantitativní profilování proteinů ve vzorcích lidské plazmy a séra v rozsáhlých kohortách. Klíčové principy zahrnují:

• Automatizovanou přípravu vzorků ve formátu 96 jamek.
• Vysoce průchozí LC–MS analýzu s přednastavenými metodami pro 30, 60 nebo 100 vzorků za den.
• Implementaci kontrol kvality pro sledování stability a citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorků:

• Automatizace na platformě Hamilton Microlab STARLet s modulem pozitivního tlaku [MPE]2.
• Thermo Scientific EasyPep Mini Mass Spectrometer Sample Prep Kit na 96j jamkovém filtračním formátu.
• Odstranění 12 nejhojnějších proteinů z plazmy spin kolonkami.
• Redukce, alkylace, trypticá digest a purifikace peptidů v automatizovaném režimu (<4,5 h pro 96 vzorků).

Chromatografie a hmotová spektrometrie:

• Evosep One LC systém s přednastavenými gradienty (30/60/100 vzorků/den).
• 8 cm kolona Dr Maisch C18 (100 µm × 8 cm, 3 µm) s EASY-Spray zdrojem.
• Q Exactive HF-X Orbitrap pro datově závislé získávání spekter (DDA).

Kontroly kvality:

• PRTC směs 15 syntetických peptideů pro sledování RT driftů a kvantitativních odchylek.
• HeLa proteinový digest standard pro sledování citlivosti a opakovatelnosti.
• Pooled plazmatické kontroly (zdraví vs. karcinom plic) pro system suitability.

Datová analýza:

• Proteome Discoverer 2.3 pro identifikaci a label-free kvantifikaci (1% FDR).
• Skyline pro vyhodnocení RT, FWHM, obsahu ploch a přesnosti hmotnosti.
• GraphPad Prism 8 pro statistické analýzy.

Hlavní výsledky a diskuse

• Automatizovaná pipetáž: CV 1,0 % vs. manuální 2,4 %, lepší přesnost a opakovatelnost.
• Peptidové výtěže: 72,1 % (automatizace) vs. 68,5 % (spin kolona), nižší CV.
• Chromatografická stabilita: RT posuny <1 % CV, plošné kvantifikace <20 % CV z 100 injekcí.
• Hmotová přesnost: ±3 ppm z 100 opakování PRTC v matrici plazmy.
• Senzitivita: 50 ng HeLa digestu metodou 60 vzorků/den odhalilo ~1 700 proteinů a ~7 500 peptidů, srovnatelné s nanoflow LC.
• Plazmatické kontroly: >200 proteinů z 500 ng depletované plazmy, detekční rozsah minimálně 4 řády velikosti.
• Kohortní studie (4 zdraví, 5 NSCLC): 117 běhů za <2 dny, QC identifikace CV <5 %, korelace R2 >0,95, odhalena heterogenita v plazmě pacientů s rakovinou.
• Potenciální biomarkery: zvýšená exprese SAA4 a SOD1 v plazmě pacientů s plicním karcinomem.

Přínosy a praktické využití metody

• Extrémně vysoká průchozí kapacita (>100 vzorků/den) s minimálními manuálními zásahy.
• Vysoká reprodukovatelnost analýzy a nízká mezivzorková kontaminace (<1 % carry-over).
• Široký dynamický rozsah detekce proteinů.
• Snadná integrace QC protokolů pro system suitability a dlouhodobé studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow o značení izobarickými TMT markery pro multiplexní analýzy.
• Adaptace na další Orbitrap nebo Tribrid systémy (Exploris, Tribrid).
• Integrace do klinických studií a populací pro epidemiologii proteomiky.
• Využití v personalizované medicíně a průmyslové QA/QC proteomiky.

Závěr

Auto matizované a standardizované workflow pro vysoce průchozí plazmatickou proteomiku kombinuje rychlou přípravu vzorků, stabilní LC–MS metody a integrované kontroly kvality. Výsledkem je robustní platforma pro kvantitativní biomarker discovery v rozsáhlých klinických kohortách.

Reference

1. Bache N. et al. A Novel LC System Embeds Analytes in Pre-formed Gradients for Rapid, Ultra-robust Proteomics. Mol Cell Proteomics. 2018;17(11):2284–2296.
2. Cho W.C.S. et al. Serum amyloid A is elevated in the serum of lung cancer patients with poor prognosis. Br J Cancer. 2010;102(12):1731–1735.
3. Papa L. et al. SOD1, an unexpected novel target for cancer therapy. Genes Cancer. 2014;5(1-2):15–21.