Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer delivers significantly increased lab productivity and reproducibility of human plasma proteome profiling from large human cohort studies

Význam tématu

Workflow pro analýzu proteomu lidské plazmy hraje klíčovou roli v objevování biomarkerů v klinických kohortních studiích. Plazma je snadno dostupná matrice, ale vysoká rozmanitost a dynamický rozsah proteinů vyžadují standardizované, vysoce výkonné a reprodukovatelné postupy, které zvládnou stovky až tisíce vzorků s minimální variabilitou.

Cíle a přehled studie

Studie prezentuje ultra-high throughput plasma protein profiling (uHTPPP) workflow navržený pro vysokou propustnost a reprodukovatelnost. Hlavním cílem bylo validovat celý proces od automatizované přípravy vzorků až po analýzu na Orbitrap Exploris 240 MS v rámci dvou laboratoří (PMSC a UNCG) a prokázat nízkou technickou variabilitu.

Použitá metodika

Workflow zahrnuje:

• Automatizovanou přípravu vzorků s použitím EasyPep 96-well MS Sample Prep Kit v 96-jamkové desce.
• Script pro Hamilton Microlab STARLet automatizující ředění plazmy, denaturaci, redukci, alkylaci, tryptickou štěpení a koncentrování peptidů.
• Oddělování peptidů pomocí Evosep One LC s „plasma profiling“ metodou 60 vzorků za den.
• Detekci na Orbitrap Exploris 240 MS s EASY-Spray ionizačním zdrojem a sloupcem Thermo Scientific EASY-Spray.
• Analýzu dat ve Proteome Discoverer se standardním nastavením pro identifikaci proteinů a peptidů.

Použitá instrumentace

• EasyPep 96-well MS Sample Prep Kit (Thermo Scientific)
• Hamilton Microlab STARLet
• Evosep One LC
• Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer
• Thermo Scientific EASY-Spray ionizační zdroj a kolona
• Proteome Discoverer software

Hlavní výsledky a diskuse

• Automatizovaná příprava vzorků vykázala nízkou variabilitu: 8,6 % CV pro sérové QC vzorky a 8,4 % CV pro plazmatické QC vzorky mezi třemi experimenti v PMSC a UNCG.
• Mezilaboratorní variabilita v počtu identifikovaných proteinových skupin a peptidů byla menší než 5 % CV.
• Platforma prokázala dlouhodobou stabilitu: přes 1 000 analyzovaných plasma sample bez potřeby rozsáhlého čištění a bez znatelného poklesu signálu.
• Doba zpracování 300 vzorků se zkrátila z více než jednoho měsíce na přibližně dva týdny.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální laboratorní zásahy díky detailnímu protokolu a automatizaci, což snižuje riziko lidské chyby.
• Rychlá adaptace do rutiních laboratoří bez nutnosti složitého ladění metod.
• Vysoká propustnost umožňuje nasazení v rozsáhlých klinických studiích a při objevování nových biomarkerů.
• Snížená technická variabilita zvyšuje důvěru v kvantitativní srovnání mezi vzorky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace strojového učení pro optimalizaci datové analýzy a identifikaci vzorců v rozsáhlých datech. Zvýšená automatizace přípravy vzorků a cloudové řešení pro správu a sdílení dat podpoří multi-centrické studie. Rozšíření workflow na ostatní biologické matrice (saliva, moč) a víceomické přístupy (metabolomika, lipidomika) umožní komplexnější biomarkerové studie.

Závěr

Uvedený uHTPPP workflow kombinuje automatizovanou přípravu vzorků, robustní LC-MS platformu a standardizovanou analýzu dat, čímž zajišťuje vysokou propustnost, nízkou variabilitu a vynikající reprodukovatelnost. Metoda významně zrychluje a usnadňuje analýzu velkých kohort plazmy, což přispívá k efektivnějšímu objevování a validaci klinických biomarkerů.

Reference

1. Trusiak S.; Snovida S.; Patel B.; Bomgarden R.; Chen E. Sampling the Human Population – Ultra-High Throughput Plasma Protein Profiling (uHTPPP) Sample Preparation for Translational Proteomics, Thermo Fisher Scientific Application Note #65727, 2020.