Real-Time Search enables a new gold standard for TMT quantitation accuracy on the Orbitrap Eclipse Tribrid mass spectrometer

Význam tématu

Označování izobarickými značkami TMT a TMTpro v kombinaci s pokročilou Orbitrap hmotnostní spektrometrií umožňuje simultánní identifikaci a kvantifikaci proteinů ve více vzorcích v jediném běhu. Přesná kvantifikace nízkoho množství peptidů a drobných změn v jejich relativní abundanci je klíčová ve výzkumu proteomiky, farmakologie i klinické aplikace, kde tradiční MS2 metody často trpí interferencemi a nižší spolehlivostí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace nové funkce Real-Time Search (RTS) mezi MS2 a SPS MS3 skeny na Orbitrap Eclipse Tribrid bylo zlepšit kvantitativní přesnost a hloubku pokrytí proteomu při TMT experimentu. Autoři demonstrovali přínos RTS pro klasické TMT11plex značení s využitím standardu Saccharomyces cerevisiae a dále rozšířili aplikaci na novou řadu TMTpro 16plex pro až šestnáctinásobné multiplexování.

Použitá metodika

Peptidový standard TMT11plex Yeast Digest Standard byl analyzován na EASY-nLC 1200 s 50 cm EASY-Spray C18 kolónou při gradientu 8–32 % acetonitrilu za 50 minut při 45 °C. Mass spektrometr nastaven na Top speed (2,5 s) s MS1 v Orbitrapu (120 000), MS2 ve vysokém rozlišení (45 000) a SPS MS3 (50 000). Real-Time Search vyhodnocuje MS2 spektrum algoritmem Comet (<5 ms) a spouští MS3 pouze při pozitivní identifikaci peptidu. Data byla zpracována v Proteome Discoverer 2.3 (SEQUEST HT, 10 ppm MS1, 0,5 Da MS2, FDR 1 %).

Použitá instrumentace

• Orbitrap Eclipse Tribrid mass spectrometer
• Thermo Scientific EASY-nLC 1200 system
• EASY-Spray C18 50 cm × 75 µm kolóna
• TMT11plex Yeast Digest Standard a TMTpro 16plex Label Reagent Set
• Proteome Discoverer 2.3 s Comet vyhledávačem

Hlavní výsledky a diskuse

Real-Time Search zvýšil počet identifikovaných peptidů o 55 % a proteinů o 53 % ve srovnání s klasickou SPS MS3 metodou a dosáhl téměř úrovně čistého MS2. Interference Free Index (IFI) vzrostl až na 95 %, což značí výrazné snížení koizolovaných nechtěných fragmentů. Analýza fragmentů ukázala, že RTS vybírá ve 91 % jen fragmenty příslušné sekvence, zatímco tradiční SPS MS3 volí až 32 % nesprávných iontů. Při použití TMTpro 16plex standardu došlo k 26% nárůstu kvantifikovaných proteinů a ke zlepšení opakovatelnosti (CV z 6 % na 3 %) i přesnosti měření pro poměry až 1:24.

Přínosy a praktické využití metody

Díky RTS lze dosáhnout vyšší hloubky proteomu a spolehlivější kvantifikace i nízkoabundantních peptidů. Metoda zvyšuje průtok vzorků, redukuje falešné signály z ko‐izolace a umožňuje robustní měření v náročných aplikacích jako jsou TKO standardy, hyperLOPIT, QMIX či single‐cell proteomika.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření RTS na PTM přizpůsobení (např. fosforylace), adaptace pro ještě vyšší multiplexing a zrychlení vyhodnocení spekter. Potenciál integrace s umělou inteligencí pro dynamické rozhodování o skenech, kombinace s novými detektory a další zlepšení spektrální dekonvoluce.

Závěr

Real-Time Search na Orbitrap Eclipse Tribrid představuje nový zlatý standard pro TMT a TMTpro kvantifikaci. Nabízí zásadní zlepšení přesnosti, hloubky proteomu a průběžného průtoku experimentů, což umožňuje výzkumníkům řešit složité biologické otázky s vyšší spolehlivostí a efektivitou.

Reference

1. Thompson A. et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 2003;75(8):1895–1904.
2. Bantscheff M. et al. Robust and sensitive iTRAQ quantification on an LTQ Orbitrap. Mol. Cell Proteomics 2008;7(9):1702–1713.
3. McAlister G.C. et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, multiplexed detection of differential expression across proteomes. Anal. Chem. 2014;86(14):7150–7158.
4. Li J. et al. TMTpro reagents: enables simultaneous proteome‐wide measurements across 16 samples. Nat. Methods 2020;17(4):399–404.
5. Robitaille A.M. et al. A quality control standard for TMT proteomic workflows. Thermo Fisher Sci. Tech. Note 72968, 2019.
6. Eng J.K. et al. Comet: an open source tandem MS sequence database search tool. Proteomics 2013;13(1):22–24.
7. Erickson B.K. et al. Active instrument engagement with real‐time database search for improved multiplexing. J. Proteome Res. 2019;18(3):1299–1306.
8. Schweppe D.K. et al. Real‐time database searching platform enables fast, accurate multiplexed quantitative proteomics. J. Proteome Res. 2020.
9. Paulo J.A. et al. A triple knockout proteomics standard for diagnosing ion interference in isobaric labeling experiments. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016;27(10):1620–1625.
10. Gygi J.P. et al. Web‐based tool for visualizing instrument performance using TKO standard. J. Proteome Res. 2019;18(2):687–693.
11. Kelstrup C.D. et al. Limits for resolving isobaric tag reporter ions using phase-constrained deconvolution. Proteome Res. 2018;17(11):4008–4016.
12. Grinfeld D. et al. Phase‐constrained spectrum deconvolution for FT‐MS. Anal. Chem. 2017;89(2):1202–1211.
13. Yu C. et al. Developing multiplexed cross‐linking MS platform for comparative structural analysis. Anal. Chem. 2016;88(20):10301–10308.
14. Dou M. et al. High‐throughput single cell proteomics enabled by multiplex isobaric labeling in nanodroplet preparation. Anal. Chem. 2019;91(20):13119–13127.