An Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer with Real-Time Search Enhances Multiplexed Proteome Coverage and Quantitation Accuracy

Význam tématu

Studium proteinových sítí a stanovení jejich absolutních i relativních množství je klíčové pro pochopení buněčných funkcí, detekci biochemických změn a vývoj léčivých postupů. Metody založené na izobarickém značení Tandem Mass Tags (TMT) umožňují multiplexní analýzu až 11 vzorků v jediném LC-MS experimentu, čímž poskytují vysokou propustnost a přesnost kvantifikace. Nicméně ko-isolace rušivých iontů a limita akviziční rychlosti při vysokém rozlišení MS2 či MS3 představují významná omezení pro kvantitativní přesnost a hloubku pokrytí proteomu. Zavedení real-time search a hardwarových inovací přináší možnost překonat tyto bariéry a dále zlepšit kvalitu kvantifikace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyhodnotit přínosy modifikovaného Orbitrap Eclipse Tribrid masového spektrometru vybaveného real-time search, pokročilými algoritmy spektrálního zpracování a optimalizovanou kvadrupólou pro analýzu TMT-značených vzorků. Autoři srovnávali standardní MS2, synchronní výběr prekurzoru (SPS) MS3 a SPS MS3 doplněný o on-the-fly datové vyhledávání v reálném čase. Hlavním zaměřením bylo zvýšení počtu identifikovaných peptidů a proteinů, zlepšení poměrové přesnosti a snížení interference při kvantifikaci.

Použitá metodika a instrumentace

Pro testovací měření byl využit standard Thermo Scientific Pierce TMT11plex Yeast Digest, který obsahuje čtyři kvasinkové kmeny s navzájem rozdílnými proteiny. HPLC separace probíhala na systému EASY-nLC 1200 s 50 cm kolonkou C18 a gradientem 8–32 % acetonitrilu za 50 min. Analýzy se uskutečnily na Orbitrap Eclipse Tribrid masovém spektrometru s kontrolním softwarem verze 3.3. Spektrální vyhledávání online zajišťoval open-source engine Comet, offline zpracování probíhalo v Proteome Discoverer 2.3 s SEQUEST HT. Použité parametry zahrnovaly rozlišovací výkon MS1 120 000, MS2 až 45 000 (nebo Turbo režim), SPS MS3 50–60 000 a dynamickou exkluzi 45 s. Nová funkce TurboTMT s algoritmem ΦSDM zlepšuje rozlišovací schopnost přímo ve spektru TMT reporter iontů bez prodloužení akvizičního času.

Hlavní výsledky a diskuse

Real-time search mezi MS2 a MS3 skeny zajistil, že se MS3 spouštěly pouze u skutečně identifikovaných peptidů, což zvýšilo počet Kvantifikovaných událostí a snížilo plýtvání časem na nerelevantní fragmenty. Díky tomu došlo k nárůstu počtu unikátních peptidů identifikovaných SPS MS3 o více než 50 % a proteinů o přibližně 55 %. TurboTMT a ΦSDM umožnily baseline rozlišení TMT izotopologů při rychlostech až 30 000–15 000 při zachování vysoké propustnosti. Měření interference free indexu ukázala, že real-time search dosahuje až 95 % spekter bez interference. Koeficient variační odchylky (CV) při SPS MS3 s real-time search se pohyboval okolo 2–4 %, oproti 6–15 % u standardních postupů, a přesnost měření (poměr naměřené/teoretické hodnoty) se výrazně přiblížila očekávaným hodnotám.

Přínosy a praktické využití metody

Integrace real-time search a pokročilého spektrálního zpracování výrazně zvyšuje efektivitu a spolehlivost TMT kvantifikace. Mezi hlavní přínosy patří:

• Vyšší hloubka proteomu díky optimalizovanému spouštění MS3 skenů
• Snížení interference a zlepšení poměrové přesnosti
• Zrychlení akvizičního cyklu při zachování rozlišení
• Možnost užší izolace prekurzorů díky vylepšené kvadrupólové optice

Metodu lze uplatnit v základním i aplikovaném výzkumu, v kvalitativních a kvantitativních studiích interakcí proteinů, farmaceutickém vývoji či klinické protokolové validaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími kroky ve vývoji kvantitativní proteomiky by mohlo být nasazení umělé inteligence pro inteligentní řízení akvizice, rozšíření multiplexace s novými izobarickými značkami nad 16 kanálů, kombinace real-time search s iontovou mobilitou (FAIMS) a adaptivní nastavení parametrů v reálném čase dle složitosti vzorku. Hardwarové inovace, jako vysokokapacitní iontové pasti s větší rychlostí skenování, dále rozšíří možnosti hluboké proteomické analýzy v rámci jednoho běhu LC-MS.

Závěr

Modifikovaný Orbitrap Eclipse Tribrid masový spektrometr s real-time search přináší významné zlepšení v počtu identifikovaných peptidů a proteinů, přesnosti kvantifikace a redukci interferencí v TMT SPS MS3 experimentech. Pokročilé algoritmy ΦSDM (TurboTMT) a optimalizovaná iontová dráha umožňují efektivnější multiplexní analýzu a otevírají nové možnosti ve vysoce průkazné proteomice.

Reference

1. Paulo J.A. et al. A Triple Knockout (TKO) Proteomics Standard for Diagnosing Ion Interference in Isobaric Labeling Experiments. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016, 27:1620–1628.
2. Erickson B.K. et al. Active Instrument Engagement Combined with a Real-Time Database Search for Improved Performance of Sample Multiplexing Workflows. J. Proteome Res. 2019, 18(3):1299–1306.
3. Schweppe D.K. et al. Characterization and Optimization of Multiplexed Quantitative Analyses Using High-Field Asymmetric-Waveform Ion Mobility Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2019, 91(6):4010–4016.