A Modified Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer with Real Time Search and Advanced Spectral Processing Enhances Multiplexed Proteome Coverage and Quantification Accuracy

Význam tématu

Využití isobarických značkovacích strategií kombinuje citlivou kvantifikaci s vysokou propustností a umožňuje současné sledování až 11 vzorků. To je klíčové pro pochopení proteinových interakcí, funkčních změn a mechanismů onemocnění v komplexních biologických systémech.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zhodnotit upravený Orbitrap Eclipse Tribrid hmotnostní spektrometr s funkcí Real Time Search (RTS) a spektrálními algoritmy ΦSDM (TurboTMT) pro zvýšení přesnosti kvantifikace a rozšíření pokrytí proteomu při TMT SPS MS3 experimentech.

Použitá metodika a instrumentace

Ve studii byl použit standard TMT11plex kvasinkového digestu (Pierce) k posouzení citlivosti, přesnosti a hloubky pokrytí.

• LC podmínky: gradient 8–32 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí, délka 50 min, teplota kolony 45 °C
• Systém: EASY-nLC 1200 spojený s EASY-Spray C18 50 cm kolonou
• MS: Orbitrap Eclipse Tribrid se softwarem Control 3.3
• Data processing: Proteome Discoverer 2.3 s vyhledávačem SEQUEST HT (10 ppm MS1, 0,5 Da MS2, 1 % FDR)
• Real Time Search: on-line vyhodnocení MS2 spekter pro řízení spouštění MS3
• TurboTMT (ΦSDM): zvýšení rozlišení reporterových iontů při kratších transientech

Hlavní výsledky a diskuse

• RTS spouští MS3 pouze při pozitivní identifikaci PSM, což vede k nárůstu počtu analyzovaných peptidů a snížení zbytečných skenů.
• TurboTMT (ΦSDM) umožňuje baseline rozlišení TMT izotopologů při MS2 rozlišení 30 000 a 15 000, čímž se zvyšuje počet identifikací a rychlost akvizice.
• Optimalizovaný kvadrupól a užší izolační okna zlepšují přenos iontů a redukují interferenci. Kvantifikace byla až 95 % bez interference.
• Ve srovnání se standardním SPS MS3 byla dosažena až o 55 % vyšší identifikace proteinů a o 53 % více peptidů.
• Standardy TKOmics a HeLa spike ukázaly snížení koeficientu variačního odchylky a přesnější naměřené poměry oproti očekávaným hodnotám.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a přesnou kvantifikaci širokého spektra vzorků, snižuje interferenci a zvyšuje efektivitu práce v laboratoři. Uplatní se ve výzkumu proteomiky, klinické diagnostice, farmaceutickém vývoji i QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace real-time algoritmů s dalšími isobarickými štítky a vyšším multiplexováním (> 16 kanálů)
• Propojení s iontovou mobilitou (FAIMS) a umělou inteligencí pro automatizaci rozhodování
• Rozvoj multi-omics přístupů a on-line kontroly kvality dat
• Použití vlastních modifikací a modulárních workflow pro specifické aplikace

Závěr

Upravený Orbitrap Eclipse Tribrid s funkcí Real Time Search a TurboTMT významně zlepšuje přesnost TMT SPS MS3 kvantifikace, proteomické pokrytí a efektivitu akvizice, což přináší robustní a škálovatelnou platformu pro náročné multiplexní proteomické analýzy.

Reference

1. Paulo et al. A Triple Knockout (TKO) Proteomics Standard for Diagnosing Ion Interference in Isobaric Labeling Experiments. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016;27:1620.
2. Erickson et al. Active Instrument Engagement Combined with a Real-Time Database Search for Improved Performance of Sample Multiplexing Workflows. J. Proteome Res. 2019;18(3):1299–1306.
3. Schweppe et al. Characterization and Optimization of Multiplexed Quantitative Analyses Using High-Field Asymmetric-Waveform Ion Mobility Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2019;91(6):4010–4016.