Implementing Comet search engine into Proteome Discoverer to improve TMT Real-Time Search data processing

Význam tématu

Real-time search (RTS) umožňuje okamžité vyhledávání MS2 spekter během analýzy, což zvyšuje účinnost a přesnost kvantifikace v TMT experimentech.
Integrace optimalizovaného post-acquisition zpracování dat s přesným zarovnáním výsledků RTS a offline analýzy je klíčová pro robustní proteomické studie.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie se zaměřuje na implementaci vyhledávacího enginu Comet do softwaru Proteome Discoverer 3.0 a porovnání s tradičním enginem Sequest HT.
Posuzuje také různé přístupy k validaci PSM (Fix Value, Target-Decoy, Percolator) z hlediska pokrytí identifikací, kvantifikace a shody s RTS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: TMT11plex Yeast Digest Standard a prototyp TMTpro 18plex Yeast Digest Standard.
Chromatografie: Thermo Scientific EASY-nLC 1200 s 50 cm EASY-Spray Column.
Hmotnostní spektrometr: Orbitrap Eclipse Tribrid (ICSW 3.5) s nastavením RTS Comet (Xcorr 1,4; dCn 0,1; tolerance 10 ppm).
Software: Proteome Discoverer 3.0 (beta), Comet 2019.01 rev.1, Sequest HT, PSM validátory (Fix Value, Target-Decoy, Percolator).

Hlavní výsledky a diskuse

Comet v Proteome Discoverer 3.0 vykázal lepší zarovnání identifikací a kvantifikací s RTS oproti Sequest HT.
Fix Value PSM Validator poskytl nejširší pokrytí, avšak bez FDR kontroly. Target-Decoy a Percolator nabízely řízený FDR (~1 %) s mírně menším počtem identifikací.
Kombinace Comet a Sequest HT vedla k nárůstu identifikovaných a kvantifikovaných proteinových skupin o 5–10 %.
Analýza distribuce Xcorr ukázala, že nejlépe odpovídá online RTS výsledek workflow s Comet a Fix Value validátorem.
Kvantitativní přesnost na TMT18plex standardu je srovnatelná pro Comet Fix Value a Percolator, nejlepší shodu k očekávaným poměrům poskytl Sequest HT Percolator.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované workflow umožňuje vyšší pokrytí proteomu a zlepšenou kvantifikaci v TMT experimentech.
Volba PSM validátoru závisí na požadavku na FDR řízení a rozsah identifikací.
Kombinace více vyhledávacích enginů zvyšuje robustnost a opakovatelnost výsledků v průmyslové i akademické praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj v integraci strojového učení pro validaci PSM a adaptivní RTS strategie.
Rozšíření multiplexních značkovacích sad nad rámec TMT18plex.
Implementace AI-driven workflow pro automatické rozhodování o dalším skenování v reálném čase.

Závěr

Implementace Comet enginu do Proteome Discoverer 3.0 významně zlepšuje shodu post-acquisition analýzy s real-time search.
Fix Value validátor je ideální pro maximální pokrytí; Percolator poskytuje přesnou FDR kontrolu.
Kombinace Comet a Sequest HT přináší synergický efekt v počtu identifikací a kvantifikací proteinů.

Reference

• Liu Y., Berg F., Barshop W.D., Canterbury J.D., Horn D., Bergen D., Huguet R., Viner R. Implementing Comet search engine into Proteome Discoverer to improve TMT Real-Time Search data processing. Thermo Fisher Scientific, 2021.