A TMTpro 18plex Proteomics Standard for Assessing Protein Measurement Accuracy and Precision

Význam tématu

Multiplexní kvantitativní proteomika s použitím TMT reagencií umožňuje současné měření více vzorků v jedné analýze. Přesto ko-isolace a interference signálů snižují přesnost a reprodukovatelnost výsledků. Standardizované referenční směsi pomáhají vyhodnotit a optimalizovat výkon hmotnostního spektrometru a metodu zpracování dat.

Cíle a přehled studie

Protikladovým přístupem vytvořit referenční standard TMTpro 18plex ze směsi rodičovské kvasinkové linie a tří knockout linií (Met6, His4, Ura2) v definovaných poměrech. Cílem bylo porovnat tři akviziční režimy (hrMS2, SPS-MS3, RTS-MS3) na různých přístrojích a vyhodnotit přesnost, linearitu a identifikaci proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Saccharomyces cerevisiae rodič + knockout linie. Lýza, redukce, alkylace, trávení LysC/Trypsinem, značení TMTpro 18plex, C18 SPE čistění.

• LC: EASY-Spray C18 50 cm, UltiMate 3000 RSLCnano, EASY-nLC 1200
• MS: Orbitrap Eclipse Tribrid, Exploris 480, FAIMS Pro
• Metody: hrMS2, SPS-MS3, RTS-MS3 (s volbou „close out“)
• Software: Proteome Discoverer 2.5/3.0, vyhledávače SEQUEST HT a COMET, FDR 1 %, prahové filtry ko-izolace

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda SPS-MS3 poskytla lepší přesnost než hrMS2, nasazení FAIMS snížilo interferenci u všech režimů. RTS-MS3 zvýšila počet kvantifikovaných proteinů až o 26 % a dále snížila pozadí v kanálech knockout proteinů. Linearita standardních křivek dosahovala R>0,98 pro koncentrace nad 12,5 %, při nejnižší dávce klesla k R≈0,90.

Přínosy a praktické využití metody

Referenční standard umožňuje:

• Orientovat se v přesnosti a citlivosti multiplexních kvantitativních workflow
• Vyhodnotit optimalizaci metodiky (gradient, akviziční režim, FAIMS)
• Podpořit QA/QC laboratoří zaměřených na TMT experimenty

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na vyšší plexní formáty, různé modelové organismy či lidské vzorky. Integrace umělé inteligence pro adaptivní výběr iontů v reálném čase a další zlepšení real-time search strategií.

Závěr

Navržený TMTpro 18plex yeast digest standard spolehlivě hodnotí přesnost a reprodukovatelnost kvantitativních proteomických metod. RTS-MS3 s FAIMS Pro ukázal nejlepší výkon a výrazně rozšířil počet identifikovaných proteomů.

Reference

1. Paulo J.A., O’Connell J.D., Gygi S.P. A triple knockout (TKO) proteomics standard for diagnosing ion interference in isobaric labeling experiments. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016;27(10):1620–1625. doi:10.1007/s13361-016-1434-9.