LC/MS Analysis of the Monoclonal Antibody Rituximab Using the Q Exactive Benchtop Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza monoklonálních protilátek hraje klíčovou roli ve vývoji a kontrole biologických léčiv, zejména protilátek jako rituximab používaných v onkologii a autoimunitních onemocněních. Vysoká heterogenita glykosylace a přítomnost variant sekvence vyžaduje spolehlivé a citlivé analytické metody pro potvrzení integrity produktu, sledování modifikací a zajištění kvality v průběhu vývoje a výroby biofarmak.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje optimalizovaný LC–MS workflow založený na dvou formátech monolitických kapilárních kolonek spojených s Q Exactive Orbitrap detektorem pro komplexní charakterizaci rituximabu. Hlavní cíle byly:

• Stanovení hmotnosti intaktní protilátky a jejích podjednotek
• Potvrzení a verifikace aminokyselinové sekvence light a heavy chain
• Identifikace a kvantifikace hlavních glykokonjugátů
• Vyhodnocení citlivosti metody pro nízké množství vzorku

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek rituximabu byl dialyzován, redukován a v případě bottom-up experimentu alkylován a tráven trypsinem. Chromatografie proběhla na:

• monolitické koloně PepSwift 250 × 0,2 mm (flow 1 µl/min, gradient 20–60 % B za 10 min)
• monolitické koloně ProSwift RP-10R 50 × 1 mm (flow 60 µl/min, gradient 26–80 % B za 20 min)

Detekce a fragmentace byla realizována na Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap MS s NanoFlex/HESI zdrojem. Parametry zahrnovaly rozlišení až 140 000, AIF a cílené top-down HCD MS/MS, doplněné Full MS-dd top10 experimenty pro digesované peptidy.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní rytuximab byl detekován s rozlišením isotopických vzorců až při 80 % Source CID. Deconvoluce Full MS spekter identifikovala pět hlavních glykoforem (G0F, G1F, G2F apod.) s hmotnostní odchylkou < 12 ppm.
Chromatografické oddělení redukovaných řetězců light a heavy proběhlo s baseline separací obou podjednotek. Light chain bylo možné zaznamenat s monoisotopickou přesností 2,5 ppm, heavy chain dekonvoluce odhalila tři dominantní glykovarianty.
Sled citlivosti ukázal detekci intaktní protilátky až od 500 pg na sloupci PepSwift a 5–10 ng na ProSwift kolonce.
Top-down fragmentace (AIF i cílené MS2) poskytly pokrytí terminálních oblastí sekvence light chain 28 % (15 % teoretických fragmentů) a heavy chain přibližně 20 fragmentů. Bottom-up digest navíc potvrdil 100 % pokrytí light chain a 99,5 % heavy chain (včetně glykopetidu EEQYN*STYR, *=G0F).

Přínosy a praktické využití metody

Navržené workflow umožňuje komplexní charakterizaci mAb včetně:

• Rychlé detekce a kvantifikace glykovariant
• Bezpečného potvrzení sekvence a modifikací
• Vysoké citlivosti pro analýzu nízkých množství vzorku
• Integrovaného top-down a bottom-up přístupu pro validaci produktu

Metoda je vhodná pro QA/QC kontrolu, vývoj biosimilars a režimy stabilitních studií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vylepšení mohou směřovat k automatizaci data-driven dekontaminace glycovariací a AI-podpoře interpretace top-down dat. Rostoucí výkon Orbitrap technologií umožní hlubší mapování PTM i složitějších protilátek (bispecifické či konjugované drug-antibody conjugates). Integrace ion mobility a vícerozměrných chromatografií otevře cestu k rozlišení svrchnějších variant konformací a ladění glykommerické složitosti.

Závěr

Workflow kombinuje rychlou chromatografii monolitických kapilár s vysokým rozlišením Orbitrap MS pro detailní analýzu rituximabu. Metoda nabízí přesné stanovení molekulové hmotnosti, potvrzení sekvence, citlivou detekci glykovariant a schopnost pracovat s velmi nízkými množstvími vzorku. Celkově představuje spolehlivý nástroj pro akcelerovanou charakterizaci a kontrolu kvality monoklonálních protilátek.

Reference

1. Premstaller A., Oberacher H., Huber C.G. High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry of Single- and Double Stranded Nucleic Acids Using Monolithic Capillary Columns. Anal. Chem. 2000, 72, 4386–4393.
2. DrugBank: rituximab sequence reference DB00073.
3. Nebija D., Kopelent-Frank H., Urban E., Noe C.R., Lachmann B. Comparison of two-dimensional gel electrophoresis patterns and MALDI-TOF MS analysis of trastuzumab and rituximab. J. Pharm. Biomed. Anal. 2011, 56, 684–691.
4. Kuribayashi R., Hashii N., Harazono A., Kawasaki N. Rapid evaluation for heterogeneities in monoclonal antibodies by LC/MS with column-switching. J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 67–68, 1–9.