Rituximab Biosimilar Analysis Using the Agilent InfinityLab Pro iQ Plus LC/MS

Analýza biosimilárního rituximabu pomocí Agilent InfinityLab Pro iQ Plus LC/MS — shrnutí

Význam tématu:
Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčové bioterapeutika s rychle rostoucím využitím. S vypršením patentů roste potřeba biosimilárních verzí, které musí prokázat analytickou podobnost vůči originálnímu produktu. Rychlá a spolehlivá charakterizace molekulové hmotnosti a heterogenity glykosylace je klíčová pro hodnocení kvality, kompatibility a regulačního schválení biosimilárních produktů.

Cíle a přehled studie / článku:
Cílem bylo ověřit použitelnost jednočočkového (single‑quadrupole) LC/MS systému Agilent InfinityLab Pro iQ Plus pro charakterizaci intactních mAb a jejich redukovaných subjednotek (LC a HC) na modelu rituximabu: originálního inovátora a dvou komerčních biosimilárů. Hodnoceny byly molekulové hmotnosti, profil hlavních glykoforem (G0F, G1F, G2F) a přítomnost rozdílů, zejména C‑terminálních variací (lysinu). Data byla zpracována dekonvolucí spekter v OpenLab CDS a porovnána s teoretickými průměrnými hmotnostmi.

Použitá metodika a instrumentace:
Krátce o přípravě vzorku:

• Intact mAb: původní 10 mg/mL zředěno na 500 ng/µL v startovním LC/MS pufru, injekční objem 1 µL.
• Redukované subjednotky: 1 mg/mL v 50 mM NH4HCO3 (pH 8.0) s 4 M guanidinem HCl a 20 mM DTT, inkubace 60 °C/60 min, následné ředění na 250 ng/µL, injekční objem 2 µL.

Chromatografie a podmínky:

• Kolona: Agilent PLRP‑S, 2.1 × 50 mm, 5 µm.
• Mobilní fáze: A = voda + 0.1 % HCOOH, B = acetonitril + 0.1 % HCOOH.
• Flow: 0.4 mL/min; teplota kolony 60 °C; termostat 5 °C uváděn pro systém (v některých parametrech).
• Gradienty: separátní programy pro intact a redukované subjednotky (rychlé eluce, krátké běhy, post time 4 min).

MS parametry a zpracování:

• Detektor: Agilent InfinityLab Pro iQ Plus, single‑quadrupole, rozsah m/z až 3 000; ESI Agilent Jet Stream, pozitivní ionizace.
• Nastavení skenování: intact m/z 1 500–3 000 (běžně využitá část obálky nabití), redukované m/z 600–2 500; scan time 2 000 ms.
• Důležité napětí a podmínky: fragmentor 275 V (intact) / 175 V (reduced), capillary 4 500 V, nozzle 2 000 V, gas temp 350 °C, sheath gas 360 °C, nebulizer 50 psi.
• Software: Agilent OpenLab CDS v2.8; dekonvoluce pomocí nástrojů OpenLab (parametry: např. max charge 60, MW rozsahy pro intact 140–160 kDa, pro reduced 10–60 kDa, relativní prah 20 %, algoritmus curve fit apod.).
• Teoretické hmotnosti vypočteny pomocí NIST Mass and Fragment Calculator (průměrné elementární hmotnosti).

Hlavní výsledky a diskuse:

• Systém dokázal detekovat intactní mAb (~147 kDa) i redukované subjednotky (LC ~23 kDa, HC ~50 kDa) s jasnou identifikací hlavních glykoforem G0F, G1F a G2F.
• Při intactním měření byla kvůli limitu m/z (max 3 000) zachycena pouze část obálky nabití (m/z 2 000–3 000), přesto dekonvoluce poskytla rozlišitelné glykoformy.
• Biosimilární produkt označený jako Biosimilar 1 vykazoval velmi vysokou shodu s inovátorem ve všech hlavních glykoformách; Biosimilar 2 byl výrazně heterogennější.
• Heterogenita Biosimilaru 2 souvisí především s variacemi C‑terminálního lysinu (0/1/2 Lys), kdy každá ztráta lysinu posouvá hmotnost přibližně o –128.2 Da a vytváří vícečetné, překrývající se špičky. To komplikuje interpretaci u přístrojů s jednofotonovým rozlišením jednotkového hmotnostního kroku.
• Mass accuracy: většina intactních glykoform vykazovala odchylky v rozmezí přibližně −17.5 až +22.9 Da (což odpovídá přibližně −119 až +155 ppm v některých extrémech), avšak většina měření byla v praxi pod ~±100 ppm. U redukovaných subjednotek byla přesnost lepší (odchylky v rozsahu ~−62 až +28 ppm; většina v desítkách ppm), což zjednodušuje přidělení LC a HC glykoforem.
• Redukované subjednotky výrazně zjednodušily spektrální interpretaci — LC se jevila jako jednostranný vrchol, HC ukázala tři hlavní glykoformy a u Biosimilaru 2 i rozdělení podle lysinových variant.
• Metoda vyžaduje minimální přípravu, je přenosná z dřívějších metod pro mAb a je vhodná pro rychlé srovnávací studie.

Přínosy a praktické využití metody:

• Single‑quadrupole InfinityLab Pro iQ Plus nabízí kompaktní a cenově dostupné řešení pro rutinní QC: lot release, screening klonů a časné fáze vývoje biosimilárů.
• Rychlá analýza intactních mAb a subjednotek s dostatečnou citlivostí pro rozlišení hlavních glykoforem usnadňuje pravidelný monitoring kvality během vývoje a výroby.
• Redukovaný subunit workflow zlepšuje schopnost jednoznačně přiřadit glykoforové varianty a identifikovat post‑translační modifikace, které komplikují intactní analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití:

• Integrace vyššího rozlišení (např. QTOF nebo Orbitrap) bude nadále důležitá pro detailní mapování heterogenity (např. plné rozlišení lysinových stádií či drobných glykokonjugátů) a pro přesnější stanovení drobných hmotnostních posunů.
• Automatizace zpracování dat a pokročilá dekonvoluční algoritmy (lépe zvládající překrývající se obálky nabití a vícečetné varianty) zvýší spolehlivost interpretace při rutinním použití.
• Rozvoj standardizovaných QC workflow založených na single‑quadrupole platformách může zlevnit a zrychlit screening velkého počtu vzorků v průmyslovém prostředí.
• Možné kombinace intact/subunit/release glykan analýzy nabídnou komplexnější obraz struktury glykosylace při zachování efektivity a stručnosti metodiky.

Závěr:
Studie prokázala, že Agilent InfinityLab Pro iQ Plus single‑quadrupole LC/MS je robustní, rychlou a nákladově efektivní platformou pro porovnávací analýzu rituximabového inovátora a biosimilárů. Metoda poskytuje spolehlivé intactní a subunit hmotnostní profily a dovoluje rozlišit blízkou podobnost (biosimilar 1) od heterogenější varianty (biosimilar 2) způsobené zejména variacemi C‑terminálního lysinu. Platforma je vhodná pro rutinní QC a fáze vývoje, přičemž pro extrémně detailní charakterizaci heterogenity může být žádoucí doplnění o vysokorozlišenou MS techniku.

Použitá instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC (G7132A pumpa, G7137A multisampler, G7116B multicolumn thermostat).
• Agilent InfinityLab Pro iQ Plus mass detector (G6170A), Agilent Jet Stream ESI.
• Kolona: Agilent PLRP‑S, 2.1 × 50 mm, 5 µm (p/n PL1912‑1502).
• Software: Agilent OpenLab CDS v2.8 (vč. dekonvolučního modulu).

Reference:

1. Dϋbel S., Reichert J. M. Handbook of Therapeutic Antibodies, 2nd ed.
2. U.S. Public Health Service Act section 351(k).
3. Rituximab information booklet. Versus Arthritis, 2022.
4. Kilpatrick E. L.; et al. Expression and Characterization of 15N‑Labeled Human C‑Reactive Protein in Escherichia coli and Pichia pastoris for use in Isotope‑Dilution Mass Spectrometry. Protein Expression Purif. 2012, 85, 94–99.
5. Monitoring Antibody Glycosylation at Intact and Subunit Levels Using a Single Quadrupole LC/MS, Agilent Technologies application note, 5994‑8345EN, 2025.
6. A Comparative Study of the Intact Mass, Subunit Mass, and Released Glycans of Two Rituximab Biosimilars Using High‑Resolution LC/MS, Agilent Technologies application note, 5994‑1653EN, 2024.
7. Hu Z.; et al. Carboxypeptidase D is the Only Enzyme Responsible for Antibody C‑Terminal Lysine Cleavage in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Biotechnol. Bioeng. 2016, 113, 2100–2106.