Advantages of Oasis PRiME HLB for the LC-MS/MS Analysis of Vitamin D Metabolites in Serum for Clinical Research

Význam tématu

Kontrola hladin vitaminu D a jeho metabolitů v séru je zásadní pro klinický výzkum a diagnostiku řady onemocnění, včetně osteoporózy, autoimunitních a kardiovaskulárních onemocnění. Přítomnost matrice fosfolipidů může vést k potlačení signálu v LC-MS/MS analýze, což snižuje citlivost a spolehlivost stanovení. Vysoce selektivní a reprodukovatelná příprava vzorku proto významně přispívá k validitě výsledků.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout rychlou a spolehlivou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D3, 25-hydroxyvitaminu D2, 24,25-dihydroxyvitaminu D3 a C3-epi-25-hydroxyvitaminu D3 v séru. Studie porovnávala tři postupy extrakce: jednoduchou precipitaci bílkovin, SPE s Oasis HLB a SPE s Oasis PRiME HLB s cílem minimalizovat fosfolipidové interferencí a maximalizovat analytickou citlivost.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky (100 µl séra) byly před analýzou doplněny stabilně značenými interními standardy a ošetřeny methanol/zinečnatým síranem. Extrakce probíhala na Oasis PRiME HLB µElution SPE destičce s optimalizovaným programem promývání 25 % acetonitrilem a elucí 100 % acetonitrilem. Chromatograficky byly metabolity separovány na ACQUITY UPLC HSS PFP kolonce (2,1 x 100 mm) s gradientem vody, methanolu, amonného acetátu a kyseliny mravenčí. Detekce probíhala na Xevo TQ-S micro MS v režimu MRM s přizpůsobenými přechody a kolizní energií.
Instrumentace:

• Waters ACQUITY UPLC I-Class (FTN)
• Waters Xevo TQ-S micro Mass Spectrometer
• Oasis PRiME HLB µElution SPE Plate
• ACQUITY UPLC HSS PFP Column, 2.1 x 100 mm

Hlavní výsledky a diskuse

Eluční profil ukázal, že při >90 % acetonitrilu zůstávají LysoPC fosfolipidy retinovány na PRiME HLB, zatímco vitaminové metabolity jsou uvolněny. Metoda odstranila >99 % cílených LysoPC v porovnání s běžnou HLB SPE a precipitací. To vedlo k 5× až 10× zvýšení signálu vitaminových metabolitů. Kalibrační křivky v rozsahu 0,5–374 nmol/l měly koeficient r² >0,99. Rozlišení epimerů (C3-epi) a isobarů (25,26(OH)2D3) bylo dosaženo za run time <8 minut. Celková přesnost a repeteabilita (≤8,2 % CV) a analytická citlivost (S/N >10 při 0,5–1 nmol/l) splňovaly požadavky pro klinický výzkum. Porovnání s DEQAS a NIST referencemi potvrdilo minimální bias (≤±1 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné potlačení interferencí fosfolipidů bez nutnosti derivatizace.
• Rychlá a automatizovatelná extrakce s vysokou reprodukovatelností.
• Vysoká citlivost a specifičnost vhodná pro klinické studie a standardizované měření.
• Úspora času a spotřebního materiálu ve srovnání s tradičními postupy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší aplikace SPE technologií typu PRiME HLB pro další lipofilní analyty v klinické a environmentální analýze. Integrované automatizované workflow s vysokou propustností přispěje k masivnímu nasazení v diagnostice. Další výzvy představuje rozšíření panelů vitaminových metabolitů, jejich vzájemné korelace a multi-omics přístupy v personalizované medicíně.

Závěr

Popsaná metoda využívající Oasis PRiME HLB významně zlepšuje kvantifikaci vitaminu D metabolitů v séru díky odstranění přebytečných fosfolipidů, vysoké citlivosti a reprodukovatelnosti. Výsledek umožňuje rychlé a spolehlivé sledování biologicky významných sloučenin v klinickém výzkumu bez komplikovaného předúpravy.

Reference

Wardle R., Calton L. Advantages of Oasis PRiME HLB for the LC-MS/MS Analysis of Vitamin D Metabolites in Serum for Clinical Research. Waters Technology Brief. 2017.