Analysis of 25-Hydroxyvitamin D in Serum for Clinical Research

Význam tématu

Seriové stanovení 25-hydroxyvitaminu D je klíčové pro pochopení jeho role nejen v kostním metabolismu ale i v dalších onemocněních jako jsou rakovina, roztroušená skleróza či kardiometabolická onemocnění. Přesné a reprodukovatelné měření 25OHD2 a 25OHD3 je nezbytné pro klinický výzkum a optimalizaci suplementace vitaminem D.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout semi-automatizovanou metodiku pro analýzu celkového 25-hydroxyvitaminu D v lidském séru pomocí UPLC-MS/MS s využitím Oasis HLB µElution Plate technologie a plné sledovatelnosti vzorků od barcodu až po výsledek v LIMS. Kombinace extrakce na Tecan Freedom Evo 100/4 a chromatograficko-hmotnostní detekce na ACQUITY UPLC I-Class a Xevo TQD umožňuje vysokou propustnost vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metody:

• Proteinová precipitace: 150 µL séra, 20 µL vnitřního standardu [2H3] a 150 µL roztoku zinečnaté soli, 600 µL methanolu, odstředění 750 g
• SPE: Oasis HLB µElution Plate, kondice a equilibrace methanolem, náběr vzorku, mytí 5 % a 60 % methanolu, eluce 95:5 methanol–IPA
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class, kolona BEH Phenyl 2,1 × 50 mm, 1,7 µm, gradient 35–2 % eluentu A/B, 0,45 mL/min, doba analýzy 4,2 minuty
• Detekce: Xevo TQD, ESI+, režim MRM, přechody pro 25OHD2, 25OHD3 a vnitřní standardy [2H3]
• Automatizace: Tecan Freedom Evo 100/4, MassLynx v4.1 s TargetLynx, Tecan File Converter, LIMS Interface

Hlavní výsledky a diskuse

• Preciznost: celková i opakovatelnost ≤ 7,3 % RSD pro koncentrace 20–300 nmol/L
• Analytická citlivost: LoD 2,56 nmol/L (25OHD2), 4,07 nmol/L (25OHD3); LoQ 3,60 nmol/L a 5,56 nmol/L
• Linearita: rozsah 7–450 nmol/L, koeficient determinace r2 > 0,996 na 40 příležitostech
• Recovery: 95,7–104,6 % při doplňování vzorků v rozsahu až 225 nmol/L
• Interference: žádné významné, kromě C3-epi epimerů spolupřiléhajících ke 25OHD
• Přenos vzorků: bez znatelného carryover
• Shoda s DEQAS: Demingova regrese y = 1,02x + 0,07, bez systematické či proporční chyby

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaná extrakce a SPE µElution zkracují dobu přípravy a eliminují kroky odpařování a rekonstituce. Metoda umožňuje analýzu až 192 vzorků za směnu, minimalizuje zásahy operátora a zajišťuje plnou sledovatelnost vzorků a dat od barcodu až po export do LIMS.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zavádění plně automatizovaných LC-MS/MS workflow v klinických laboratořích
• Rozšíření panelu analyzovaných metabolit vitamínu D a dalších biomarkerů
• Integrace vysokozátěžových platforem pro studiový výzkum
• Využití HRMS a metabolomiky pro hlubší profilaci vitamínu D
• Aplikace umělé inteligence pro pokročilou analýzu dat

Závěr

Vyvinutá semi-automatizovaná metoda pro stanovení 25OHD2 a 25OHD3 v lidském séru poskytuje vynikající preciznost, citlivost a linearitu. Automatizace přípravy vzorku a využití µElution SPE zkracují analytické kroky a zvyšují propustnost a reprodukovatelnost výsledků. Metoda je vhodná pro rozsáhlé klinické studie a kvantitativní i kvalitativní výzkum vitamínu D.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class
• ACQUITY UPLC BEH Phenyl, 1,7 µm, 2,1 × 50 mm
• Xevo TQD
• Tecan Freedom Evo 100/4
• Oasis HLB µElution Plate
• MassLynx v4.1, TargetLynx, Tecan File Converter, LIMS Interface