Simultaneous Quantification of 25-Hydroxyvitamin D3, 25-Hydroxyvitamin D2, and 24,25-Dihydroxyvitamin D3 in Clinical Research Studies By UPLC-MS/MS

Význam tématu

Správné stanovení hladin 25 hydroxyvitaminu D3, 25 hydroxyvitaminu D2 a 24,25 dihydroxyvitaminu D3 je klíčové pro hodnocení nutričního a metabolického stavu vitaminu D u lidí i modelových organismů. Metabolit 24,25 dihydroxyvitaminu D3 odráží aktivitu enzymu CYP24A1 a pomáhá určit rychlost clearance 25 hydroxyvitaminu D3. Současné metody často vyžadují větší objemy vzorku nebo samostatné analýzy více metabolitů, což omezuje jejich využití v klinickém i preklinickém výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout spolehlivou a citlivou metodu umožňující souběžné kvantifikování 25 hydroxyvitaminu D3, 25 hydroxyvitaminu D2 a 24,25 dihydroxyvitaminu D3 v jediném běhu s využitím pouhých 100 µl séra. Metoda má zkrátit čas analýzy, minimalizovat objem vzorku a umožnit studium vitaminu D i v modelových systémech s omezeným objemem vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci a analýzu bylo využito následujícího postupu a vybavení

• Lekvividně kapalná extrakce spojená s chemickou derivatizací reagencí DMEQ TAD
• Acquity UPLC se sloupcem BEH Phenyl 1 7 µm 2 1 × 50 mm při teplotě 40 °C
• Xevo TQ S hmotnostní spektrometrie v režimu pozitivní ESI a MRM přechodů

Klíčové kroky přípravy vzorku

• Odběr 100 µl séra, ředění 200 µl vody a přidání deuterovaných interních standardů
• Proteinová precipitace přidáním HCl a roztoku síranu zinečnatého v metanolu
• Organická extrakce hexan MTBE a odpaření pod dusíkem
• Derivatizace DMEQ TAD ve dvou inkubacích při pokojové teplotě
• Rozpuštění suchého rezidua v 60 40 (v v) methanol voda pro UPLC

Chromatografické podmínky

• Objem injekce 10 µl, tok 400 µl min
• Mobilní fáze A voda s 2 mm acetátem amonným a 0 1 formiovou kyselinou B methanol se stejnými přísadami
• Gradient z 35 65 u A B na 10 90 u B během 5 minut s návratem do výchozího stavu do 6 minut

Hmotnostní spektrometrie

• MRM přechody 25 OH D3 m z 746 6 > 468 3 25 OH D2 m z 758 6 > 468 3 24 25 OH2 D3 m z 762 6 > 468 3
• Desolvace 650 °C plyn 1000 l h kužel 150 l h napětí 1 0 kV

Hlavní výsledky a diskuse

Derivatizace DMEQ TAD zlepšila ionizační efektivitu a potlačila rušivé pozadí. Chromatografické oddělení epimeru 3 epi 25 OH D3 zaručilo specifické stanovení 25 OH D3 bez interferencí. Metoda vykázala v rozsahu kalibrace lineární závislost s koeficienty determinace vyššími než 0 997 pro všechny analyty. Meze kvantifikace byly odhadnuty mezi 0 1 až 0 2 ng ml a meze detekce až 0 04 ng ml. Vnitroběhová imprecizita (CV) se pohybovala mezi 3 a 4 a meziběhová mezi 4 a 7. Přesnost porovnáním s DEQAS vzorky vykázala odchylky -2 pro 25 OH D3 a -5 pro 25 OH D2.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a citlivé stanovení tří klíčových metabolitů vitaminu D z minimálního objemu séra. Díky robustnosti a vysokému proudu dat je vhodná pro klinické studie, preklinické modely a in vitro experimenty s omezeným materiálem.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směřování vývoje zahrnuje rozšíření panelu metabolitů vitaminu D, plnou automatizaci přípravy vzorku, vysokoprůtočnou analýzu a integraci s dalšími omickými metodikami. Dále lze metodu adaptovat pro diagnostiku poruch metabolismu vitaminu D v klinické praxi.

Závěr

Popsaná UPLC MS MS metoda poskytuje vysoce citlivé a selektivní stanovení derivatizovaných metabolitů vitaminu D ve stopových koncentracích z malého objemu vzorku. Vysoká přesnost, nízké imprecision a možnost simultánního měření tří sloučenin ji činí ideální pro široké spektrum výzkumných aplikací.

Reference

1. Jones G Metabolism and biomarkers of vitamin D Scand J Clin Lab Invest Suppl 2012 243 7–13
2. Jones G Prosser DE Kaufmann M 25 Hydroxyvitamin D 24 hydroxylase CYP24A1 its important role in the degradation of vitamin D Arch Biochem Biophys 2012 523 1 9–18
3. Zhu JG Ochalek JT Kaufmann M Jones G DeLuca HF CYP2R1 is a major but not exclusive contributor to 25 hydroxyvitamin D production in vivo Proc Natl Acad Sci USA 2013 110 39 15650–5
4. Higashi T Awada D Shimada K Simultaneous determination of 25 hydroxyvitamin D2 and 25 hydroxyvitamin D3 in human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry employing derivatization with a Cookson type reagent Bio Pharm Bull 2001 24 7 738–43