An Offline Automated Solid-Phase Extraction Method for Measurement of Serum 25-Hydroxyvitamin D for Clinical Research

Význam tématu

Analýza sérové koncentrace 25-hydroxyvitaminu D je nezbytná pro hodnocení vitaminového stavu pacientů a pro výzkum souvislostí s onemocněními, jako jsou rakovina, kardiovaskulární choroby nebo autoimunitní poruchy. Zvýšený objem klinických vzorků vyžaduje metody s vysokou přesností, reprodukovatelností a propustností. Kombinace LC-MS/MS a automatizované přípravy vzorků umožňuje eliminovat nevýhody imunoanalytických testů, zejména omezenou ko-specificitu pro 25(OH)D2 a 25(OH)D3.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat offline automatizovaný postup pevné fáze extrakce (SPE) sérových vzorků pro měření total 25(OH)D pomocí UPLC-MS/MS. Klíčové body:

• automatizované uvolnění 25(OH)D z vazebných proteinů a odstranění matricových interferencí,
• integrace sledování vzorků od primární zkumavky po výsledná data,
• ověření linearity, přesnosti, preciznosti a zotavení,
• porovnání s referenční hexanovou LLE LC-MS/MS metodou z Bristol Royal Infirmary.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnoval tyto kroky: proteinovou precipitaci (ZnSO4 + methanol), automatizovanou SPE na Oasis HLB μElution destičkách a chromatografickou separaci na ACQUITY UPLC BEH Phenyl kolonce. Detekce využila vícečetného sledování (MRM) v pozitivním režimu ESI. Klíčové instrumenty a software:

• Offline Automated Sample Preparation System (OASPS) pro robotizované dávkování a práci s 96-jamkovými destičkami,
• Oasis HLB μElution SPE destičky pro rychlou extrakci a eliminaci kroků odpařování,
• ACQUITY UPLC System s BEH Phenyl kolonkou (2.1×50 mm, 1.7 µm),
• ACQUITY TQD MS detektor v režimu MRM,
• MassLynx 4.1 a TargetLynx Application Manager pro akvizici a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Analytické parametry metody:

• Linearity r2 > 0.997 v rozsahu 2.5–220 ng/mL pro oba analyty,
• Intra-assay preciznost (CV) ≤ 7.7 %, inter-assay CV < 12 %,
• Přesnost ověřená DEQAS externími QC vzorky: odchylky ≤ 10.8 %,
• Zotavení 25(OH)D2 i 25(OH)D3 > 80 % v celém analytickém rozsahu,
• Minimální iontové potlačení díky optimalizované chromatografii a čištění,
• Srovnání s hexanovou LLE metodou: regresní vztah Waters = 0.98×BRI + 1.47 ng/mL (r2 = 0.96), bias +1.3 ng/mL.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované workflow přináší významné výhody:

• redukce manuálních kroků a chyb operátora,
• zkrácení přípravy 96 vzorků na ~2 hodiny,
• možnost zpracovat až 192 vzorků za směnu,
• vysoká reprodukovatelnost a spolehlivost výsledků pro klinický výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se zaměří na plnou integraci s laboratorními informačními systémy (LIMS), rozšíření na další vitamíny a metabolity, adopci vysokopropustných screeningů a využití umělé inteligence pro pokročilou analýzu dat. Možné je i přizpůsobení pro automatizované klinické platformy point-of-care.

Závěr

Navržená offline automatizovaná metoda SPE v kombinaci s UPLC-MS/MS nabízí robustní, přesné a vysoce propustné řešení pro měření sérového 25-hydroxyvitaminu D. Eliminuje náročné manuální kroky, minimalizuje variabilitu a umožňuje efektivní zpracování velkého počtu vzorků v klinickém výzkumu.

Reference

1. Gorham ED, et al. Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: quantitative meta-analysis. Am J Prev Med. 2007;32:210–6.
2. Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Grant WB, Giovannucci EL, Lipkin M, et al. Vitamin D and prevention of breast cancer: pooled analysis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2007;103:708–11.
3. Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes Institute of Medicine. Dietary Reference Intakes for calcium, phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. National Academy Press; 1997.
4. Hollis B. The Determination of Circulating 25-Hydroxyvitamin D: No Easy Task. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89(7):3149–51.
5. Passing H, Bablok W. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. J Clin Chem Biochem. 1983;21:709–20.
6. Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 1986;1:307–10.