Analysis of Testosterone, Androstenedione, and Dehydroepiandrosterone Sulfate in Serum for Clinical Research

Význam tématu

Analýza steroidních hormonů testosteronu, androstenedionu a dehydroepiandrosteron sulfátu (DHEAS) má v klinickém výzkumu klíčový význam pro pochopení regulace pohlavních znaků, endokrinních poruch a vyhodnocení léčebných zásahů. Přesné a reprodukovatelné stanovení nízkých fyziologických koncentrací těchto látek vyžaduje vysoce selektivní a citlivé metody s nízkým objemem vzorku, minimalizací interferencí a možností automatizace pro vysokou průchodnost laboratoří.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem popisované studie bylo vyvinout a validovat klinicko-výzkumnou metodu pro současnou extrakci a kvantifikaci testosteronu, androstenedionu a DHEAS ze séra pomocí SPE Oasis PRiME HLB µElution a následné LC-MS/MS analýzy. Metoda byla automatizována na platformě Tecan Freedom Evo 100/4 a prověřena ve srovnání s externími kvalitativními schématy (EQA).

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: 100 µL séra doplněný o interní standardy (13C3-testosteron/androstenedion, 2H5-DHEAS), metanol a vodu.
• Extrakce: Oasis PRiME HLB µElution Plate, mytí formiát/amoniak v metanolu, eluční objem 45 µL metanolu + 55 µL vody.
• Automatizace: Tecan Freedom Evo 100/4 Liquid Handler.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class s VanGuard pre-column a HSS T3 kolonkou, teplota 50 °C, gradient 0–4,7 min, mobilní fáze voda/methanol s 2 mM octanem amonným a 0,1 % kyselinou mravenčí.
• Detekce: Xevo TQD, režim MRM, ESI pozitivní pro testosteron a androstenedion, negativní pro DHEAS.
• Softwarové zpracování: MassLynx v4.1 s TargetLynx.

Hlavní výsledky a diskuse

• Selektivita: Výborné rozlišení testosteronu od epitestosteronu a separace ostatních steroidů (DHEA, 17-OHP, kortikosteron atd.) bez interferencí.
• Sensitivita: Kvantifikace při S/N >10:1 na hladinách 0,17 nmol/L (testosteron, androstenedion) a 0,14 µmol/L (DHEAS).
• Preciznost: Celková přesnost QC ≤6,3 %, opakovatelnost ≤5,2 % pro všechny hladiny.
• Linearita: Rozsahy 0,15–76 nmol/L (testosteron), 0,15–74 nmol/L (androstenedion), 0,13–58 µmol/L (DHEAS) s r2 > 0,998.
• Matrix efekt: Faktor 0,93–1,09, RSD 4,6–6,8 %, potlačení/podsouhlasné účinky minimální.
• Srovnání s EQA metodou: Demingova regrese ukázala střední bias 5,0 % (testosteron), –3,3 % (androstenedion), –6,3 % (DHEAS); Altman-Bland bias –0,50 %, 0,4 %, 5,8 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a spolehlivou analýzu nízkých koncentrací androgenů v malém objemu vzorku, minimalizuje manipulaci a riziko kontaminace díky automatizované SPE. Vhodná pro klinické výzkumy, farmakokinetické studie a monitorování endokrinních terapií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření panelu steroidů o glukokortikoidy a mineralkortikoidy.
• Integrace do multiplexních testů pro komplexní steroidní metabolomiku.
• Využití pokročilých technik ionizačního zdroje (ion mobility) ke zvýšení selektivity.
• Nasazení do rutinních klinických laboratoří s validací pro diagnostické účely.

Závěr

Popisovaná LC-MS/MS metoda s použitím Oasis PRiME HLB SPE a automatizace poskytuje vysokou citlivost, selektivitu i reprodukovatelnost při analýze testosteronu, androstenedionu a DHEAS v séru. Výsledky validace prokazují vhodnost metody pro náročné klinické výzkumné aplikace.

Reference

1. Foley D., Calton L. A Clinical Research Method for the Analysis of Serum Testosterone and Androstenedione. Waters application note. 2015. p/n 720005274EN.