Peptide Mapping of Monoclonal Antibody (mAb) Using LCMS-9030 (Q-TOF) Mass Spectrometerwith a Shim-pack GISS-HP Column

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují významnou třídu bioterapeutik, která vyžaduje precizní kontrolu kvality. Peptidové mapování umožňuje potvrdit primární strukturu protilátky, ověřit chemické modifikace i konzistenci výrobního procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo zkrátit dobu běhu peptidového mapování monoklonální protilátky (biosimilárního bevacizumabu) z původních 120 minut na pouhých 45 minut a zároveň zachovat úplné pokrytí aminokyselinové sekvence. K provedení optimalizace byla použita kombinace UHPLC systému Nexera X2 a kvadrupólového časově-oflightového (Q-TOF) hmotnostního spektrometru LCMS-9030.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek biosimilárního bevacizumabu (5 mg/mL) byl připraven v 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) a podroben denaturaci, redukci (DTT) a alkylaci (iodoacetamid). Po naředění následovala noční trypsinová digesce při 37 °C a zastavení kyselinou trifluoroctovou. Analýza probíhala na:

• UHPLC: Shimadzu Nexera X2
• Kolona: Shim-pack GISS-HP C18, 3 µm, 150 × 3,0 mm
• Mobilní fáze: voda s 0,1 % FA + 0,01 % TFA (A) a acetonitril s 0,1 % FA + 0,01 % TFA (B)
• Gradient: 0–2 min 0 % B → 15 % (10 min) → 35 % (23 min) → 45 % (30 min) → 75 % (35–40 min) → návrat na 0 % (40–45 min)
• Tok: 0,5 mL/min, teplota kolony 40 °C, objem injekce 20 µL
• MS: Shimadzu LCMS-9030 Q-TOF, Heated ESI (pozitivní mód), rozmezí m/z 100–2000, TOF analyzátor

Hlavní výsledky a diskuse

Díky úpravě gradientního programu a použití UHPLC kolony se doba analýzy snížila ze 120 minut na 45 minut. Opakovatelnost retence (<0,1 % RSD) a ploch vrcholu (<3 % RSD) byla výborná. Celkem bylo identifikováno 19 peptidů z lehkého a 42 peptidů z těžkého řetězce. Měřené hmotnosti se od teoretických lišily o méně než 3 ppm. Dosáhnuto bylo 100 % pokrytí sekvence lehkého řetězce a 99,8 % u těžkého, přičemž jedinou odchylkou bylo ořezání C-terminální lysinu u jednoho peptidu.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný postup nabízí:

• Výrazné zrychlení analýzy peptidového mapování
• Vysokou reprodukovatelnost a přesnost měření hmotností
• Komplexní potvrzení primární struktury mAb pro výzkum i kontrolu kvality

Budoucí trendy a možnosti využití

V budoucnu lze očekávat integraci s automatizovanými platformami, využití multiplexních značkovačů pro kvantitativní analýzu a rozšíření aplikace na monitorování posttranslačních modifikací v reálném čase.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace UHPLC Nexera X2 a LCMS-9030 Q-TOF umožňuje rychlé, reprodukovatelné a vysoce přesné peptidové mapování mAb s praktickým významem pro vývoj biosimilárů a kontrolu kvality.

Reference

• Shimadzu (Asia Pacific), Peptide Mapping of Monoclonal Antibody (mAb) Using Nexera Bio with Q-TOF Mass Spectrometer for Full Sequence Confirmation, Application News No. AD-0176, 2018.
• MacLean B. et al., Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments, Bioinformatics, 26(7):966–968, 2010.