Microwave Digestion and On-line Pre-Column Derivatization UHPLC Method for Analysis of Total Amino Acids in Feed

Význam tématu

Analýza celkového složení aminokyselin v krmivech je zásadní pro optimalizaci výživy a zdraví hospodářských i domácích zvířat. Rychlé a spolehlivé stanovení esenciálních i neesenciálních aminokyselin přispívá ke zlepšení krmného plánu, prevenci nedostatků a zvýšení produkční výkonnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat zkrácenou, plně automatizovanou metodu pro stanovení 20 aminokyselin v krmných směsích spojující mikrovlnnou digesci a on-line precolumn derivatizaci s UHPLC analýzou.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Mikrovlnnou acidobazickou hydrolýzu (6N HCl a 4N NaOH) v digesteru Milestone ETHOS EASY za teplot 180–210 °C a doby 15–45 minut.
• On-line precolumn derivatizaci v autosampleru SIL-40C X3 s OPA/MPA pro primární a FMOC pro sekundární aminokyseliny.
• UHPLC systém Shimadzu Nexera LC-40 X3 s kolónou Shim-pack Scepter C18 (150×3 mm, 3 µm), gradientním elucí a detekcí fluorescenčním (RF-20Axs) a UV-PDA (SPD-M40).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace hydrolyzy prokázala nejlepší výtěžnost většiny AK při 195 °C po 15 min (s výjimkou Trp a Ile). On-line derivatizace zajistila linearitu (R2 ≥ 0,999) v rozsahu 1–500 µmol/L, LOQ: 4,9–75 nmol/L (RF) a 1,6–5,0 µmol/L (PDA). Reprodukovatelnost byla vysoká (RSD ≤ 0,12 % pro retenční časy; ≤ 3,9 % pro plochy). Metoda byla ověřena na dvou vzorcích krmiva s celkovým obsahem esenciálních AK 3,67–4,76 mg/g a neesenciálních 5,31–10,08 mg/g.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby hydrolyzy z 24 hodin na 15–30 minut.
• Úplná automatizace vzorkovací a derivatizační sekvence.
• Vysoká citlivost a spolehlivost analýzy aminokyselin pro rutinní QC a výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Zavedení mikrofluidních digesterů, rozšíření detekčních modulů (MS), aplikace na složitější biologické a potravinářské matrice, integrace s automatizovanými systémy řízení kvality.

Závěr

Popsaná metoda kombinuje mikrovlnnou digesci a on-line derivatizaci s UHPLC-PDA/RF analýzou pro rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení 20 aminokyselin v krmivech. Vysoká efektivita a robustnost metody umožňují její široké uplatnění ve výzkumu i průmyslu.