Automated Analysis of Thirty-seven D/L-amino Acids using Liquid Chromatography with Fluorescence Detection and Its Application to Liquor Samples

Význam tématu

Aminokyseliny vykazují chirální formy D a L, které ovlivňují kvalitu, chuť a stabilitu potravin i biochemické procesy. Přesná separace a kvantifikace obou enantiomerů je klíčová pro potravinářskou analýzu, farmacii či biologický výzkum.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout automatizovaný HPLC postup pro rychlé a spolehlivé stanovení 37 proteinogenních D/L-aminokyselin včetně aplikace na vzorky alkoholických nápojů. Studie kombinuje dvě komplementární derivatizační reakce a automatizaci přípravy mobilních fází i předkolonové derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Derivatizace:

• OPA/N-acetyl-L-cystein (NAC) pro část aminokyselin (červené spektrum)
• OPA/N-isobutyryl-L-cystein (NIBC) pro zbytek (modré spektrum)

Automatizace:

• Předkolonová derivatizace v autosampleru (míchání reagenčních i vzorkových roztoků v jehle)
• Příprava mobilních fází funkcí low-pressure gradient pumpy s automatickým blendingem organických rozpouštědel a pufru

HPLC podmínky:

• Systém: Shimadzu Nexera X3 (130 MPa tolerance tlaku)
• Kolona: Shim-pack Scepter 1.9 μm C8, 150 × 3 mm
• Průtok: 0,6 mL/min, teplota 35 °C
• Detekce: fluorescence RF-20AXS (Ex 350 nm, Em 450 nm)

Hlavní výsledky a diskuse

Kompletní oddělení všech 37 D/L-aminokyselin bylo dosaženo v jednotné analýze trvající ~120 min s využitím dvou derivatizačních protokolů. Reprodukovatelnost retencí <0,1 % RSD a ploch <1,5 % RSD (n = 6); lineární kalibrace v širokém rozsahu s r2 ≥ 0,999.
Automatizace přípravné fáze snížila pracovní čas na 20 vzorků z 85 min manuálně na 15 min automaticky. Aplikace na pivo, saké, červené i bílé víno prokázala přítomnost D-aminokyselin ve všech vzorcích; D-Gln a D-Trp jen ve vínech, D-Phe pouze v pivech. Relativně nízké koncentrace D-isomerů ve srovnání s L-formami potvrzují vysokou selektivitu metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce reprodukovatelná separace D/L-aminokyselin bez potřeby MS či komplikovaného 2D-LC
• Výrazná úspora času a pracovní náročnosti díky automatizaci derivatizace a přípravy mobilních fází
• Nízké provozní a spotřební náklady (žádné jednorázové kazetové lampy, méně odpisů)
• Vhodné pro potravinářskou kontrolu kvality (QA/QC), biomedicínský výzkum i monitorování fermentačních procesů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zkrácení doby analýzy díky optimalizaci gradientů či využití rychlých sloupců
• Integrace HPLC-FLD s hmotnostní spektrometrií pro rozšíření na nestandardní a posttranslačně modifikované aminokyseliny
• On-line monitoring fermentací a bioprocesů v potravinářství
• Automatizace ve formátu mikrofluidních či vestavěných systémů pro vysokoprůtokové aplikace

Závěr

Navržený postup kombinuje dvě chirální derivatizace, plnou automatizaci předkolonové přípravy vzorků a mobilních fází, čímž poskytuje vysokou selektivitu, reprodukovatelnost a efektivitu stanovení 37 D/L-aminokyselin. Metoda je rychlá, robustní a uživatelsky nenáročná.

Reference

V textu nebyly explicitně uvedeny citace literatury.