Amino Acid Analysis - Application Notebook

Význam tématu

Aminokyselinová analýza je základním nástrojem v proteinové charakterizaci, biotechnologickém výzkumu, monitoringu buněčných kultur i v hodnocení nutriční kvality potravin a krmiv. Rychlá a přesná identifikace a kvantifikace jednotlivých aminokyselin je nezbytná pro optimalizaci výrobních procesů biopharma, kontrolu kvality průmyslových vzorků a vývoj nových analytických protokolů.

Cíle a přehled studie / článku

Předložená aplikace popisuje Waters UPLC Amino Acid Analysis Solution – integrované řešení pokrývající derivatizaci, separaci, detekci, software a podporu. Cílem je demonstrovat přenositelnost metod z HPLC na UPLC, vysokou produktivitu, reprodukovatelnost výsledků a modulární volbu detektorů (UV, PDA, fluorescenční) pro různorodé aplikace.

Použitá metodika a instrumentace

Předsložková derivatizace 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl karbamátem (AccQ•Tag Ultra Reagent), následuje separace na kolóně AccQ•Tag Ultra BEH C18 (2,1×100 mm, 1,7 µm) při 55 °C použitím quaternárního gradientu eluenty A–D. Detekce je prováděna:

• UV detektorem TUV @260 nm
• fotodiodovým PDA detektorem @260 nm (2D spektrální režim)
• fluorescenčním detektorem (Ex 266 nm/Em 473 nm)

Systém řízen Empower softwarem, objem injekce 1 µl, průtok 0,7 ml/min, doba eluce 9–10 min. Pro přípravu hydrolyzátů je možné využít tradiční kyselý či alkalický hydrolyzátor nebo mikrovlnečné přístroje (CEM Discover SP-D). Interním standardem je norvalin.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje sedminásobného zkrácení doby analýzy (9–10 min vs. >1 h u HPLC) při zachování rozlišení ≥1,6 a linearity signálu (>50 fmol–50 pmol). Reprodukce retencí <0,01 min a vysoká opakovatelnost ploch píků (RSD <2 %) potvrzují robustnost. Analýzy BSA hydrolyzátu a složitého krmiva ukazují shodu stanovených poměrů aminokyselin s očekávanou sekvencí a deklarovanými hodnotami potravin. Fluorescenční detekce neposkytuje významně vyšší kvantitativní citlivost než UV, jejíž limity jsou dány nejméně fluoreskujícím tyrosinem. PDA umožňuje navíc spektrální verifikaci čistoty píků.

Přínosy a praktické využití metody

Řešení přináší eliminaci outsourcingu analýz, návratnost investice do 8 měsíců, snížení spotřeby acetonitrilu 10× a výrazné zrychlení pracovního toku. Umožňuje automatizované přidávání reagencií, dávkování vzorků robotem i integraci do procesního monitoringu bioreaktorů. Aplikace zahrnují kontrolu výroby biopharma, charakterizaci proteinových hydrolyzátů, sledování nutrientů v kulturách, nutriční analýzu potravin a krmiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj UPLC-MS/MS metod pro kvantifikaci biogenních aminů, využití multidimenzionální chromatografie, on-line PAT monitoring ve výrobě, miniaturizace a mikrofluidické platformy, automatizace derivatizace a přípravy vzorků. Vznik nových derivačních chemikálií umožní širší detekční módy a vyšší specifičnost.

Závěr

Waters UPLC Amino Acid Analysis Solution představuje univerzální, rychlou a vysoce reprodukovatelnou platformu s flexibilním výběrem detekčních modulů. Metoda výrazně zvyšuje laboratořní produktivitu, snižuje provozní náklady a nabízí robustní řešení pro široké spektrum aplikací v analytické chemii a biotechnologii.